本文關(guān)鍵詞：單藥CHK1抑制劑通過(guò)提高復(fù)制壓力靶向治療放療不敏感乳腺癌細(xì)胞

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【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菫榉暖煵幻舾腥橄侔┘?xì)胞(RBCC)尋找更合適的靶向治療藥物。方法:采用生物醫(yī)學(xué)常用蛋白質(zhì)印記、克隆形成、免疫熒光、流式細(xì)胞檢測(cè)、彗星實(shí)驗(yàn)、DNA纖維實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?進(jìn)行比較對(duì)照細(xì)胞及其經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期離子射線照射之后形成的放療不敏感乳腺癌細(xì)胞中DNA損傷應(yīng)答的改變,進(jìn)而觀察CHK1抑制劑在聯(lián)合放療后或僅僅單藥處理之后對(duì)細(xì)胞造成的不同影響。結(jié)果:DNA損傷修復(fù)蛋白ATR/CHK1/BRCA1/Ct IP在放療不敏感乳腺癌細(xì)胞中出現(xiàn)高表達(dá),并且在放療不敏感乳腺癌細(xì)胞中同源重組(HR)的細(xì)胞修復(fù)機(jī)制被激活。雖然CHK1抑制劑AZD7762限制了同源重組的活性,但其并沒(méi)有使放療不敏感乳腺癌細(xì)胞恢復(fù)對(duì)放療的敏感性。然而,在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中我們卻發(fā)現(xiàn)AZD7762單藥竟然明顯的抑制了放療不敏感乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此我們提出假說(shuō):CHK1抑制劑可以通過(guò)釋放原本被抑制的癌基因誘導(dǎo)的復(fù)制壓力,進(jìn)而特異性的殺死放療不敏感乳腺癌細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)相比對(duì)照組細(xì)胞,在放療不敏感乳腺癌細(xì)胞中癌基因c-Myc/CDC25A/c-Src/H-ras/E2F1出現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài)。同樣,相比對(duì)照組細(xì)胞在放療不敏感乳腺癌細(xì)胞中經(jīng)過(guò)AZD7762處理之后DNA損傷明顯增多,并且增加了復(fù)制起始點(diǎn),從而消耗脫氧核苷酸而導(dǎo)致復(fù)制進(jìn)行速度減慢,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。結(jié)論:雖然在放療不敏感乳腺癌細(xì)胞中激活了癌基因通路,使得該細(xì)胞中復(fù)制壓力出現(xiàn)明顯增高,但其卻通過(guò)依賴CHK1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而維持正常存活。因此,我們的研究通過(guò)使用CHK1抑制劑釋放上調(diào)的復(fù)制壓力,使細(xì)胞累積過(guò)多損傷的DNA無(wú)法正常修復(fù)進(jìn)而特異性的殺死放療不敏感乳腺癌細(xì)胞。在今后臨床治療中出現(xiàn)的乳腺癌放療不敏感的問(wèn)題,提示使用CHK1作為其靶向治療藥物的可能性。
【關(guān)鍵詞】：DNA雙鏈損傷 乳腺癌 復(fù)制壓力 CHK1抑制劑 放療不敏感
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-11
• 1 材料與方法11-16
• 1.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)11
• 1.2 蛋白質(zhì)印記（Western Blot）11-12
• 1.3 免疫熒光分析（Immunofluorescence analysis）12-13
• 1.4 轉(zhuǎn)染以及感染13
• 1.5 同源重組分析13
• 1.6 細(xì)胞周期分析13-14
• 1.7 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)14
• 1.8 彗星實(shí)驗(yàn)（Comet assay）14
• 1.9 克隆形成實(shí)驗(yàn)（Colony formation assays）14-15
• 1.10 DNA纖維測(cè)定實(shí)驗(yàn)（DNA Fiber assay）15
• 1.11 LC--MS/MS的方法定量測(cè)定細(xì)胞裂解液中ATP和dATP15
• 1.12 異種移植模型（Xenograft studies）15-16
• 2 結(jié)果16-25
• 2.1 單藥 CHK1 抑制劑可以明顯抑制放療不敏感乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)但卻不能恢復(fù)其放療的敏感16-17
• 2.2 乳腺癌放療不敏感細(xì)胞中表現(xiàn)出癌基因的高表達(dá)和高水平的復(fù)制壓力17-19
• 2.3 在放療不敏感乳腺癌細(xì)胞中CHK1抑制劑上調(diào)復(fù)制壓力表現(xiàn)明顯19-20
• 2.4 在放療不敏感乳腺癌細(xì)胞 MCF7/C6 中 CHK1 抑制劑導(dǎo)致復(fù)制起始點(diǎn)明顯增多20-22
• 2.5 在放療不敏感乳腺癌細(xì)胞中 CHK1 抑制劑導(dǎo)致了復(fù)制叉速度進(jìn)展的明顯減慢和脫氧核苷酸的供應(yīng)不足22-23
• 2.6 CHK1抑制劑明顯降低了放療不敏感乳腺癌細(xì)胞同源重組的能力23-25
• 3 討論25-27
• 4 結(jié)論27-28
• 參考文獻(xiàn)28-32
• 綜述32-45
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 致謝45-46
• 在學(xué)期間研究成果46-47
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷47

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