本文關(guān)鍵詞：miR-141-3p對前列腺癌LNCaP細(xì)胞生長的影響及其作用機(jī)制的探討

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【摘要】：前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤,在發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率及死亡率一直居高不下,在我國近年來的發(fā)病率亦呈上升趨勢。目前已有越來越多的研究表明,mi RNA通過發(fā)揮癌基因或抑癌基因的功能,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。mi RNA是細(xì)胞內(nèi)長約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA,mi RNA通過結(jié)合靶m RNA的3'UTR來抑制目的m RNA的翻譯或降解,從而調(diào)控目的基因的表達(dá)。mi R-141是mi R-200家族成員之一,其編碼基因位于12號染色體,mi R-141的前體pre-mi RNA在胞漿內(nèi)可加工生成mi R-141-3p和mi R-141-5p兩種成熟mi RNA。研究顯示,與正常前列腺組織相比,mi R-141(mi R-141-5p)在前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào),并且可以在前列腺癌患者的外周血中檢測到。一項(xiàng)針對早期前列腺癌患者和轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的血清mi RNA的小樣本研究顯示,mi R-141和mi R-375是重要的診斷和評估預(yù)后的生物分子標(biāo)志物。Lodes等對前列腺癌患者的血清mi RNA表達(dá)譜進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,與正常對照相比,前列腺癌患者血清中有15種mi RNA表達(dá)上調(diào),其中mi R-141與局部進(jìn)展性前列腺癌具有相關(guān)性。上述有關(guān)mi R-141相關(guān)文獻(xiàn)中用到的均為mi R-141-5p(5’-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3’)的功能,mi R-141-3p在前列腺癌組織中表達(dá)如何,在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中是否發(fā)揮作用,尚不清楚。研究顯示,前列腺的發(fā)展與雄激素受體(androgen receptor,AR)信號調(diào)控通路密切相關(guān)。雄激素通過結(jié)合AR,使AR下游的信號通路被激活,從而將胞外信號傳遞至胞內(nèi),并作用于目標(biāo)基因來發(fā)揮作用。對于早期前列腺腫瘤細(xì)胞而言,其生長對雄激素有依賴性,故臨床中減少雄激素甚至是阻斷雄激素是治療早期前列腺癌的有效方法。但是,對于那些雄激素非依賴性前列腺腫瘤細(xì)胞,內(nèi)分泌治療并不能獲得良好療效。同時(shí),這類腫瘤細(xì)胞中AR的表達(dá)量和AR陽性細(xì)胞在整體腫瘤組織中并未明顯減少,甚至還有升高的趨勢。亦有研究顯示,SHP(微小異二源聚體)是mi R-141的靶基因,在人前列腺癌細(xì)胞中上調(diào)mi R-141的表達(dá)之后,SHP的表達(dá)下降,從而促進(jìn)AR的轉(zhuǎn)錄活性。提示,mi R-141和AR之間有一定的相互作用。本課題組前期對多種前列腺腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞中mi RNA-141-3p的表達(dá)進(jìn)行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LNCa P細(xì)胞中,mi R41-3p明顯低表達(dá)。并且,利用Targetscan、Micro Cosm等生物信息學(xué)預(yù)測軟件分析發(fā)現(xiàn),在AR基因的3’UTR區(qū)有mi R-141-3p的可能結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步對mi R-141-3p低表達(dá)在LNCa P細(xì)胞生長及增殖中作用及其是否通過靶向AR而發(fā)揮作用的機(jī)制進(jìn)行探討,有利于從新的角度認(rèn)識前列腺癌發(fā)生機(jī)制,并為靶向前列腺癌治療提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:(1)利用Real-time PCR方法,檢測LNCa P前列腺癌細(xì)胞,PC-3前列腺癌細(xì)胞,Sao S-2骨肉瘤細(xì)胞,Si Ha宮頸癌細(xì)胞,BEAS-2B正常肺上皮細(xì)胞,HUVEC靜脈內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)mi R-141-3p的表達(dá);(2)采用MTT檢測、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞凋亡檢測技術(shù),檢測了mi R-141-3p對LNCa P細(xì)胞增殖和凋亡的影響;(3)利用Targetscan、Micro Cosm等軟件分析mi R-141-3p的可能靶基因,(AR3’UTR);(4)轉(zhuǎn)染mi R-141-3p mimics后,RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測LNCa P細(xì)胞內(nèi)AR的表達(dá);(5)構(gòu)建p MIR-AR-3’UTR熒光報(bào)告載體,將p MIR-AR-3’UTR、內(nèi)參質(zhì)粒p RL-luciferase、Negative control mimics、mi R-141-3p mimics、Negative control inhibitor、mi R-141-3p inhibitor分別轉(zhuǎn)染LNCa P細(xì)胞,檢測雙螢光素酶的活性;(6)構(gòu)建p MIR-AR-3’UTR突變載體,將p MIR-AR-Mut、內(nèi)參質(zhì)粒p RL-luciferase、Negative control mimics、mi R-141-3p mimics、Negative control inhibitor、mi R-141-3p inhibitor分別轉(zhuǎn)染LNCa P細(xì)胞,檢測雙螢光素酶的活性;(7)化學(xué)合成ARE序列,將其連入p GL3-Promoter Vector載體,構(gòu)建p GL3-ARE熒光報(bào)告載體,檢測雙螢光素酶的活性;(8)RT-PCR等技術(shù)檢測AR下游靶基因CDC6和MKX的表達(dá)。結(jié)果:(1)RT-PCR結(jié)果顯示,與正常細(xì)胞BEAS-2B和HUVEC相比,mi R-141-3p在LNCa P細(xì)胞中低表達(dá),在骨肉瘤Sao S-2細(xì)胞和宮頸癌Si Ha細(xì)胞中高表達(dá)。(2)MTT檢測、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示,mi R-141-3p可以抑制LNCa P細(xì)胞的增殖,促進(jìn)LNCa P細(xì)胞的凋亡。(3)生物信息學(xué)預(yù)測軟件Targetscan、Micro Cosm等分析可能作用于AR 3’UTR的mi RNA,結(jié)果顯示,mi R-141-3p的種子序列與AR m RNA的3’UTR區(qū)有很高的互補(bǔ)性。(4)PCR結(jié)果顯示,與對照組(轉(zhuǎn)染Negative control mimics)相比,實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染mi R-141-3p mimics)細(xì)胞中AR m RNA水平明顯下降;Western blot結(jié)果顯示,與對照組(轉(zhuǎn)染Negative control mimics))相比,實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染mi R-141-3p mimics)細(xì)胞中AR蛋白水平明顯下降。(5)雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測mi R-141-3p對AR的靶向作用結(jié)果顯示(野生型),與對照組(共轉(zhuǎn)p MIR-AR-3’UTR、內(nèi)參質(zhì)粒p RL-luciferase和陰性對照,即p MIR-AR-3’UTR-NC mimics,p MIR-AR-3’UTR-NC inhibitor)相比,實(shí)驗(yàn)組(共轉(zhuǎn)p MIR-AR-3’UTR、內(nèi)參質(zhì)粒p RL-luciferase和mi R-141-3p mimics,即p MIR-AR-3’UTR-mi R-141-3p mimics)的螢光素酶的表達(dá)含量顯著下降;實(shí)驗(yàn)組(共轉(zhuǎn)p MIR-AR-3’UTR、內(nèi)參質(zhì)粒p RL-luciferase和mi R-141-3p inhibitor,即p MIR-AR-3’UTR-mi R-141-3p inhibitor)的螢光素酶的表達(dá)含量顯著增加。(6)雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測mi R-141-3p對AR的靶向作用結(jié)果顯示(突變型),與對照組(共轉(zhuǎn)p MIR-AR-Mut、內(nèi)參質(zhì)粒p RL-luciferase和陰性對照,即p MIR-AR-Mut-NC mimics,p MIR-AR-Mut-NC inhibitor)對照組相比,實(shí)驗(yàn)組(共轉(zhuǎn)p MIR-AR-Mut、內(nèi)參質(zhì)粒p RL-luciferase和mi R-141-3p mimics、mi R-141-3p inhibitor,即p MIR-AR-Mut-mi R-141-3p mimics,p MIR-AR-Mut-mi R-141-3p inhibitor)的螢光素酶的表達(dá)量均無無明顯變化。(7)mi R-141-3p對p GL3-ARE(androgen response element,ARE)熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示:與對照組相比,mi R-141-3p可降低p GL3-ARE的相對熒光素酶活性。(8)Real-time PCR檢測結(jié)果顯示:與轉(zhuǎn)染陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染mi R-141-3p mimics后CDC6和MKX m RNA的表達(dá)水平降低;與轉(zhuǎn)染陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染mi R-141-3p inhibitor后CDC6和MKX m RNA的表達(dá)水平升高。結(jié)論:mi R-141-3p在LNCa P細(xì)胞中低表達(dá);mi R-141-3p可以抑制LNCa P細(xì)胞的增殖,促進(jìn)LNCa P細(xì)胞的凋亡;證實(shí)AR是mi R-141-3p的靶基因;mi R-141-3p可影響ARE的活性;mi R-141-3p可下調(diào)AR下游靶基因CDC6和MKX的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：前列腺癌 mi R-141-3p 雄激素受體
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-23
• 第一部分 miR-141-3p對前列腺癌LNCaP細(xì)胞生長的影響23-31
• 1 材料23-24
• 2 方法24-27
• 3 結(jié)果27-30
• 4.小結(jié)30-31
• 第二部分 miR-141-3p對前列腺癌細(xì)胞LNCaP中AR表達(dá)的調(diào)控作用31-59
• 1 材料31-33
• 2 方法33-52
• 3 結(jié)果52-58
• 4.小結(jié)58-59
• 第三部分 miR-141-3p對AR-ARE相互作用及其介導(dǎo)的信號通路的影響59-66
• 1 材料59-61
• 2 方法61-63
• 3 結(jié)果63-65
• 4.小結(jié)65-66
• 討論66-68
• 小結(jié)68-69
• 參考文獻(xiàn)69-78
• 個(gè)人簡歷和研究成果78-79
• 致謝79

【引證文獻(xiàn)】

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉游鴻;李雄;;FOXM1和雄激素受體(AR)轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)節(jié)CDC6基因轉(zhuǎn)錄DNA復(fù)制和促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)理[A];中國病理生理學(xué)會第十三屆腫瘤、第十四屆免疫專業(yè)委員會學(xué)術(shù)會議論文集[C];2012年

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本文編號：803348