本文關(guān)鍵詞：甲基轉(zhuǎn)移酶、生物硫醇檢測新方法研究

  更多相關(guān)文章： Dam甲基轉(zhuǎn)移酶 電化學(xué) 比色法 生物硫醇 金納米粒子

【摘要】：DNA甲基化在人類基因組中表觀遺傳修飾和在基因的調(diào)控中起重要作用。在異常的甲基化中,甲基轉(zhuǎn)移酶將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到CpG島上胞嘧啶的C5位置上。CpG島中基因啟動子區(qū)域異常甲基化是新一代癌癥生物標志物,因此,對于快速檢測DNA甲基化和轉(zhuǎn)移酶活性可以為早期癌癥診斷提供一種有效的方法。然而,傳統(tǒng)分析檢測甲基轉(zhuǎn)移酶的方法具有耗時、費用高以及靈敏度不高等缺點。所以,迫切需要發(fā)展新方法,實現(xiàn)快速、簡單、靈敏檢測甲基轉(zhuǎn)移酶活性,同時檢測CpG島的甲基位點可以用于確定特定的癌癥類型。為抗癌藥物發(fā)展和癌癥診斷提供了理論基礎(chǔ)。本文研究內(nèi)容主要包括以下兩個方面:(1)基于酶輔助雙信號放大的電化學(xué)方法高靈敏檢測Dam甲基轉(zhuǎn)移酶活性。首先,通過DNA雜交作用將二茂鐵-DNA(S2)組裝到巰基-DNA(S1)修飾電極表面,產(chǎn)生二茂鐵的良好電化學(xué)信號。Dam甲基轉(zhuǎn)移酶能將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基轉(zhuǎn)移到發(fā)夾DNA的腺嘌呤的N6位置上,進而限制性內(nèi)切酶Dpn I將發(fā)生甲基化的發(fā)夾DNA在甲基化位點剪切,釋放出單鏈DNA(S3)。將制備的巰基-DNA(S1)和二茂鐵-DNA(S2)修飾金電極探針浸泡在以上溶液中,釋放出的S3與修飾金電極雙鏈探針中的S2凸出的部分雜交形成新的雙鏈DNA。經(jīng)核酸外切酶III作用,能夠從新形成的雙鏈DNA的S2的3′端進行剪切,導(dǎo)致二茂鐵脫離電極表面。釋放出的S3繼續(xù)與修飾金電極雙鏈探針中的S2凸出的部分雜交形成新的雙鏈DNA而進入下一個剪切放大循環(huán),多次循環(huán),使得S2標記的二茂鐵大量脫離電極表面導(dǎo)致二茂鐵的電流強度下降,同時電極表面的大量巰基化單鏈S1被釋放出來,將電極浸泡在含有血紅素和鉀離子的溶液中,形成的G-四鏈體-血紅素復(fù)合物。電化學(xué)測量結(jié)果表明,由于二茂鐵脫離電極表面而電流降低,電極表面的單鏈S1與血紅素形成G-四鏈體-血紅素復(fù)合物而電流增強,通過二者電流強度之比即可實現(xiàn)Dam甲基轉(zhuǎn)移酶的靈敏檢測。本方法的優(yōu)點如下:(1)對Dam甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測限能夠達到4.8×10-3 U mL-1,靈敏度遠遠高于其他檢測方法;(2)對Dam甲基轉(zhuǎn)移酶識別的特異性強,其他的甲基轉(zhuǎn)移酶,如M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶,不干擾測定,所以,本方法的選擇性高;(3)可用于Dam甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的篩選,結(jié)果表明絲裂霉素、順氯氨鉑對Dam甲基轉(zhuǎn)移酶沒有影響,而青霉素和5-氟尿嘧啶對Dam甲基轉(zhuǎn)移酶的活性有明顯抑制效果,其中5-氟尿嘧啶對Dam甲基轉(zhuǎn)移酶抑制效果最強。(2)建立了一種基于SAM和金納米粒子的生物硫醇免標記比色檢測法。SAM包含一個高能的手性硫離子,該硫離子分別與甲基、無碳糖、以及甲硫氨酸連接。硫帶有孤對電子,五碳糖上含有一個高電負性的氧,能夠使硫原子的孤對電子轉(zhuǎn)移到氧原子上,從而使得SAM分子帶正電;而檸檬酸三鈉還原合成的金納米粒子表面帶負電。當(dāng)SAM與金納米粒子混合,SAM可以中和金納米粒子表面的電荷,導(dǎo)致金納米粒子之間的排斥力減小,從而使得金納米粒子發(fā)生團聚,金納米粒子溶液的顏色由紅色變成藍色。由于生物硫醇含巰基官能團,能夠通過金硫鍵作用阻礙SAM誘導(dǎo)金納米粒子的團聚,因此當(dāng)生物硫醇存在時,金納米粒子溶液顏色不變。據(jù)此,建立了生物硫醇的比色檢測方法。此外,在檢測生物硫醇的過程中,金納米粒子溶液顏色的變化還能夠通過裸眼觀察到,因此可以實現(xiàn)生物硫醇的可視化檢測。在最佳的實驗條件下,半胱氨酸、谷胱甘肽和高半胱氨酸檢測的線性范圍分別為0.4-1.2μM、0.2-0.9μM和0.6-3.0μM;檢測限分別為35.8 nM、21.7 nM和62.4 nM。與其他比色法相比,本方法的靈敏度高。本方法也能應(yīng)用檢測血清中生物硫醇的總含量,回收率范圍為96.5%到104.4%,表明檢測血清樣品中生物硫醇時沒有明顯的干擾物質(zhì)。
【關(guān)鍵詞】：Dam甲基轉(zhuǎn)移酶 電化學(xué) 比色法 生物硫醇 金納米粒子
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.4;O657.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第1章 引言9-21
• 1.1 概述9-10
• 1.2 DNA甲基化10-19
• 1.2.1 DNA甲基化的概念10-12
• 1.2.2 DNA甲基化的檢測方法12-13
• 1.2.3 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶13-19
• 1.3 本論文主要研究內(nèi)容19-21
• 第2章 基于Exonuclease III酶輔助循環(huán)放大雙電流信號檢測甲基轉(zhuǎn)移酶21-35
• 2.1 引言21-23
• 2.2 實驗部分23-26
• 2.2.1 實驗試劑23
• 2.2.2 實驗儀器23-24
• 2.2.3 金電極處理24
• 2.2.4 電極探針的制備24
• 2.2.5 DNA甲基化24-25
• 2.2.6 電化學(xué)檢測甲基轉(zhuǎn)移酶活性25
• 2.2.7 抑制劑對Dam甲基轉(zhuǎn)移酶活性影響25
• 2.2.8 Dam甲基轉(zhuǎn)移酶傳感器選擇性25-26
• 2.3 實驗結(jié)果與討論26-34
• 2.3.1 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶檢測原理26-27
• 2.3.2 Dam甲基轉(zhuǎn)移酶檢測可行性分析27-28
• 2.3.3 DNA金電極修飾和表征28-29
• 2.3.4 Dam甲基轉(zhuǎn)移酶傳感器表征29-30
• 2.3.5 實驗條件優(yōu)化30-31
• 2.3.6 Dam 甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測31-32
• 2.3.7 甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑篩選和考察32-33
• 2.3.8 選擇性實驗33-34
• 2.4 結(jié)論34-35
• 第3章 基于SAM和金納米粒子免標記比色法檢測生物硫醇35-46
• 3.1 引言35-36
• 3.2 實驗部分36-37
• 3.2.1 試劑36
• 3.2.2 儀器36-37
• 3.2.3 實驗步驟37
• 3.3 結(jié)果與討論37-45
• 3.3.1 傳感器檢測生物硫醇的實驗原理38-39
• 3.3.2 傳感器的表征39
• 3.3.3 優(yōu)化實驗條件39-41
• 3.3.4 生物硫醇的檢測41-44
• 3.3.5 傳感器在生物領(lǐng)域的應(yīng)用44-45
• 3.3.6 生物傳感器的選擇性45
• 3.4 結(jié)論45-46
• 展望46-47
• 參考文獻47-56
• 致謝56-57
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果57

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊騰飛;王爽;張萌;蘇東亮;王強;;腹腔鏡與開腹胃癌根治術(shù)后胰島素抵抗的變化及臨床意義[J];腹腔鏡外科雜志;2013年09期

2 吳瓊;邵國;張培禮;;DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶與乳腺癌相關(guān)性的研究進展[J];包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2013年06期

3 邢華;周薈;;DNA甲基化可提高早期乳腺癌的檢測[J];中國醫(yī)藥導(dǎo)刊;2013年S1期

4 王艷云;楊秋麗;劉麗霞;何秀萍;;DNMT1和HDAC1在上皮性卵巢癌組織中的表達及臨床意義[J];國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2014年03期

5 尹寶;李彥斌;韓立民;;高血壓病中醫(yī)辨證分型與血漿同型半胱氨酸(HCY)的相關(guān)性研究[J];贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2014年01期

6 刁玉巧;曲凡;楊明娟;孟建輝;朱秀麗;陳健;;兒童非霍奇金淋巴瘤ZO-1基因甲基化狀態(tài)分析及臨床意義[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2014年06期

7 徐程;豐蕾;楊帆;李彩霞;Q謎，

本文編號：803299