本文關(guān)鍵詞：手霉素增強白血病干細胞被NK細胞殺傷的敏感性

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【摘要】：背景與目的急性髓系白血病(acute myeloid leukaemia,AML)是一類惡性克隆性異質(zhì)性疾病,具有病情兇險,病死率高,易復(fù)發(fā)的特點。大量的研究表明患者體內(nèi)殘留的白血病干細胞(leukemia stem cell, LSC)是白血病耐藥和復(fù)發(fā)的根源,因此清除LSC成為根治AML的關(guān)鍵。目前關(guān)于LSC的來源仍沒有明確的結(jié)論,但比較公認的說法是LSC源自于HSC的基因突變。近年來,AML的治療已取得較大進步,其治療方法主要是化療和異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT),但有大量患者仍然會復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)的原因主要是LSC對常規(guī)化療藥物耐藥,殘留的LSC具有自我更新、增殖及分化功能,產(chǎn)生白血病細胞,從而導(dǎo)致AML患者復(fù)發(fā)。Allo-HSCT是治愈AML的重要方法,同種異體反應(yīng)性NK細胞(allo-NK)在移植物抗白血病效應(yīng)中起關(guān)鍵作用,但具有藥物抵抗和allo-NK細胞抵抗的LSC導(dǎo)致的移植后復(fù)發(fā)仍是AML治療的難點,因此研究NK細胞對LSC的免疫作用對治療AML具有重要的作用。Allo-NK細胞作為固有免疫系統(tǒng)的重要成分,具有識別正常和異常組織細胞的能力,其表面表達活化性受體(KAR)和抑制性受體(KIR),一般情況下,正常組織細胞上殺傷細胞抑制性信號占主導(dǎo)地位,故NK細胞不會殺傷正常組織,避免了自身免疫性疾病的發(fā)生,然而腫瘤細胞由于失去KIR的抑制作用,使活化性受體KAR占主導(dǎo)地位,活化性受體DNAM-1和NKG2D與腫瘤細胞表面免疫激活物(配體)結(jié)合后,激活NK細胞,一方面,NK細胞分泌穿孔素和顆粒酶等直接使腫瘤細胞溶解破壞,另一方面,NK細胞表達的TRAIL和FasL能夠與腫瘤細胞表面死亡受體DR4/5和Fas結(jié)合,誘導(dǎo)腫瘤細胞通過外源性凋亡途徑凋亡。其中,活化性受體NKG2D與其配體MHC樣分子(MHC class Ⅰ chain related A and B,MICA/B)、UL16結(jié)合蛋白家族成員(UL16-binding protein 1-3,ULBP1-3),構(gòu)成抗腫瘤免疫監(jiān)視的重要信號途徑。allo-NK細胞對白血病細胞的殺傷活性受NKG2D配體表達水平的影響。白血病細胞通過不表達或低表達NKG2D配體逃逸機體的免疫監(jiān)視,我們前期研究也發(fā)現(xiàn)LSC低表達NKG2D配體,LSC可能通過改變NK細胞受體的配體表達水平逃避免疫活性細胞的識別從而逃逸機體的免疫監(jiān)視。因此,有可能通過調(diào)節(jié)免疫激活物在LSC的表達增強免疫細胞的抗腫瘤作用,這對清除LSC有重要的意義。研究表明,LSC存在多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)異常激活,其中RAS信號通路在凋亡抵抗及逃逸免疫治療中起重要作用。RAS是ras原癌基因的蛋白產(chǎn)物。細胞漿前體形式的RAS須經(jīng)法尼基化修飾才能定位于細胞膜內(nèi)側(cè),從而傳導(dǎo)酪氨酸激酶的有絲分裂信號。RAS信號通路不但可通過激活PI3K/AKT促使LSC抵抗凋亡,也可能促使LSC下調(diào)NKG2D配體表達抵抗NK細胞的殺傷逃逸免疫治療。有研究發(fā)現(xiàn)激活ras基因及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性與NKG2D表達降低相關(guān)。手霉素(Manumycin)具有抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶的作用,其治療腫瘤是基于RAS癌基因及相關(guān)信號通路的研究。手霉素酰胺側(cè)鏈與法尼基焦磷酸酯的異戊二烯基團類似,與法尼基焦磷酸酯競爭性結(jié)合法尼基轉(zhuǎn)移酶,可以阻斷RAS相關(guān)的促有絲分裂作用,從而能誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡,因此我們設(shè)想手霉素與免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān),通過測定手霉素處理前后LSC細胞活性變化、手霉素對LSC被NK細胞殺傷敏感性的影響、對NK細胞誘導(dǎo)LSC凋亡的影響以及檢測手霉素對LSC表達免疫激活物(NKG2DL)及相關(guān)凋亡蛋白的影響,探討手霉素免疫增敏的作用及機制。方法第一章手霉素增強NK細胞對LSC的殺傷及凋亡1.CD34+CD38-LSC的分選及純度檢測；分離純化allo-NK細胞；CCK-8實驗方法檢測不同濃度手霉素對LSC的細胞毒性；LDH法檢測NK細胞(NK-92細胞及allo-NK細胞)對LSC的殺傷作用；流式細胞術(shù)檢測allo-NK細胞誘導(dǎo)LSC凋亡。2.實驗數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件進行分析,以均數(shù)±標準差(X±s)表示。兩組比較采用獨立樣本t檢驗進行分析,多組比較采用單因素方差分析進行分析,不同效靶比間NK-92/allo-NK細胞的殺傷活性比較采用析因設(shè)計方差分析進行分析；P0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。第二章手霉素增強NK細胞對LSC的殺傷及凋亡相關(guān)機制1.流式細胞術(shù)檢測手霉素干預(yù)前后LSC及陽性對照K562細胞表面NKG2D配體MICA/B和ULBP1-3的表達；Western-blot法檢測手霉素對LSC內(nèi)源性及外源性凋亡途徑關(guān)鍵蛋白分子的影響；2.實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行分析,以均數(shù)±標準差(X±s)表示。K562細胞與LSC表面NKG2D配體表達、手霉素處理前后LSC細胞表面NKG2D配體表達均采用獨立樣本t檢驗；P0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果第一章手霉素增強NK細胞對LSC的殺傷及凋亡1.CD34+CD38-LSC的分選及純度檢測采用免疫磁珠分選(負選)方法從KGla細胞株中分選CD34+CD38-LSC細胞,流式細胞術(shù)檢測分選細胞表面CD34+CD38-抗原表達率為99.98%。2.分離純化allo-NK細胞的形態(tài)健康志愿者外周血分離出的PBMC,經(jīng)Human rlL-2、Human rIL-15誘導(dǎo)刺激的第二天即開始分裂增殖,細胞生長較快,allo-NK細胞體積較小,圓形透亮,呈團簇狀生長。3.手霉素對LSC的毒性不同濃度的手霉素處理LSC 24 h后,發(fā)現(xiàn)手霉素對于LSC具有細胞毒性,且毒性呈劑量依賴性,隨著手霉素濃度的升高,對LSC的生存抑制作用越強。當(dāng)手霉素濃度達到4umol/1時,LSC達到半數(shù)抑制,即IC50為4umol/l。4.手霉素對NK細胞殺傷LSC的影響LDH法檢測結(jié)果顯示,與對NK-92細胞殺傷敏感的K562細胞相比,LSC對NK-92細胞的殺傷敏感性低,在效靶比為5：1、10：1、20：1時,NK-92細胞株對K562細胞和LSC的殺傷率分別為：(47.00±4.31% Vs24.08±1.23%、53.58±3.09% Vs27.91±2.11%、67.97±3.09% Vs 34.8±4.12%),兩組細胞在不同效靶比間的被殺傷率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.055,P0.05)。同樣地,與對allo-NK細胞殺傷敏感的K562細胞相比,LSC對allo-NK細胞的殺傷敏感性也較低,在效靶比為5：1、10：1、20：1時allo-NK細胞對K562細胞和LSC的殺傷率分別為： (43.38±1.83% Vs24.05±3.61%、66.80±1.58% Vs28.40±3.24%、73.99±4.17% Vs35.07±2.58%),兩組細胞在不同效靶比間的被殺傷率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.947,P0.05)。手霉素4umol/1處理LSC 24 h后,LSC被NK-92細胞的殺傷敏感性明顯增強,且隨著效靶比的增加而增強,在效靶比為5：1、10：1、20：1時分別為(47.53±3.35% Vs24.08±1.23%、62.78±2.70% Vs27.91±2.11%、72.65±3.38% Vs34.89±4.12%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.704,P0.05); LSC被allo-NK細胞的殺傷敏感性也明顯增強,且隨著效靶比的增加而增強,在效靶比為5：1、10：1、20：1時分別為(71.51±2.94% Vs24.05±3.61%、89.47±1.07% Vs28.40±3.24%、93.47±0.90%Vs 35.07±2.58%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.456,P0.05)。5.手霉素增強allo-NK細胞誘導(dǎo)LSC凋亡流式檢測結(jié)果顯示,手霉素處理組相比于對照組而言,凋亡率升高,8.16±0.36%Vs 1.19±0.37%,兩組細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在效靶比為10：1時allo-NK細胞誘導(dǎo)LSC的凋亡率為4.13±0.33%,而手霉素4umol/1處理LSC 24 h后,allo-NK細胞誘導(dǎo)LSC的凋亡率是11.38±0.47%,明顯增高,比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),表明手霉素可增強allo-NK細胞誘導(dǎo)LSC的凋亡。第二章手霉素增強NK細胞對LSC的殺傷及凋亡相關(guān)機制1.手霉素上調(diào)LSC表面NKG2D配體表達LSC表面NKG2D配體MICA/B、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表達明顯低于對NK細胞敏感的K562細胞,比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),提示LSC對NK細胞殺傷不敏感可能與NKG2D配體低表達有關(guān),手霉素可能通過上調(diào)NKG2D配體增強NK細胞殺傷LSC。結(jié)果顯示手霉素4 umol/1處理LSC 24 h后,LSC表面NKG2D配體的表達增加,MICA/B、ULBP1、ULBP2、ULBP3分別為(8.38±0.12% Vs0.62±0.26%、12.94±3.16% Vs0.33±0.15%、9.24±0.96%Vs0.83±0.15%、43.03±2.65% Vs0.66±0.44%),比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),表明手霉素可上調(diào)LSC表面NKG2D配體的表達。2.手霉素對LSC凋亡途徑相關(guān)蛋白的影響手霉素干預(yù)LSC Oh,6h,12h,18h,24h后,提取蛋白,測定蛋白濃度,免疫印跡法檢測內(nèi)外源性凋亡途徑關(guān)鍵分子的變化。結(jié)果顯示：外源性凋亡途徑中,Fas隨干預(yù)時間的延長而逐漸表達增加,pro-caspase8逐漸減少,說明手霉素能夠上調(diào)Fas蛋白表達,活化pro-caspase8,促進LSC外源性凋亡途徑；線粒體凋亡途徑中,pro-caspase9和pro-caspase3逐漸減少,pro-PARP在18h左右開始明顯減少,蛋白表達降低,說明手霉素可能影響LSC內(nèi)源性凋亡途徑即線粒體途徑；Bcl-2家族關(guān)鍵蛋白的變化：抑凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2隨時間延長都逐漸減少,促凋亡蛋白Bax隨時間變化沒有改變。結(jié)論1.手霉素對LSC具有細胞毒作用；2.LSC對NK-92細胞及allo-NK細胞抵抗,手霉素可增強LSC被NK-92細胞及allo-NK細胞的殺傷敏感性；3.手霉素可上調(diào)LSC表面NKG2D配體的表達增強LSC被NK-92細胞及allo-NK細胞殺傷的敏感性；4.手霉素增強LSC被NK-92細胞及allo-NK細胞殺傷的敏感性可能與其上調(diào)外源性凋亡通路關(guān)鍵分子Fas和下調(diào)Bcl-xl和Bcl-2,激活線粒體凋亡途徑有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：手霉素 白血病干細胞 NK-92細胞 allo-NK細胞 NKG2D配體
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-24
• 第一章 手霉素增強NK細胞對LSC的殺傷及凋亡24-47
• 1.1 實驗材料25-27
• 1.2 實驗方法27-34
• 1.3 實驗結(jié)果34-40
• 1.4 討論40-47
• 第二章 手霉素增強NK細胞對LSC的殺傷及凋亡相關(guān)機制47-64
• 2.1 實驗材料47-51
• 2.2 實驗方法51-55
• 2.3 實驗結(jié)果55-59
• 2.4 討論59-64
• 全文總結(jié)64-65
• 參考文獻65-73
• 英文縮略詞73-75
• 在讀期間發(fā)表論文75-76
• 致謝76-77

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