本文關(guān)鍵詞：RNAi沉默Rap2B基因?qū)盒赞D(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞的作用

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【摘要】：目的Rap2B在肺癌組織中高表達。Rap2B表達量增高能夠激活NF-κB通路以及MAPK亞通路P38活化。本研究擬通過RNAi技術(shù)沉默Rap2B基因,觀察Rap2B基因被沉默后,細(xì)胞內(nèi)NF-κB、p38在m RNA及蛋白質(zhì)水平的表達以及細(xì)胞的克隆形成率、增殖能力、遷移能力、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化,探索Rap2B在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用,為將Rap2B作為一種治療肺癌的高效、特異的生物靶標(biāo)提供理論支持。方法1.以B(a)P為染毒物,染毒BEAS-2B細(xì)胞,構(gòu)建惡性轉(zhuǎn)化的BEAS-2B細(xì)胞系。設(shè)立空白對照組、二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)溶劑對照組、苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene,B(a)P)染毒組。采用RT-PCR、Western blot技術(shù)檢測各組Rap2B基因和蛋白的表達情況。2.小干擾RNA(Small Interfering RNA,si RNA)通過Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染惡性轉(zhuǎn)化的BEAS-2B細(xì)胞,從3條si RNA序列中篩選出1條沉默Rap2B基因的最佳序列,RT-PCR驗證其結(jié)果;觀察Rap2B基因被沉默后,細(xì)胞內(nèi)p65、p38在m RNA及蛋白質(zhì)水平的表達以及細(xì)胞的克隆形成率、增殖能力、遷移能力、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化。結(jié)果1.惡性轉(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞的建立經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和軟瓊脂克隆形成實驗,表明細(xì)胞發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化。2.Rap2B在惡性轉(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞中的表達B(a)P組Rap2B基因m RNA表達量高于空白對照組和DMSO組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.001);B(a)P組Rap2B蛋白表達量高于空白對照組和DMSO組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.001)。3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和Rap2B基因干擾效率的檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染6h后,熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率為90.39%;干擾Rap2B基因效果最佳的si RNA為Rap2b-homo-814,干擾效率為82.3%。4.沉默Rap2B基因后細(xì)胞的增殖和遷移能力變化MTT法觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的生長狀況:干擾Rap2B基因后能夠明顯抑制惡性轉(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞的生長,與RNAi-組、NC組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P㩳0.001);劃痕實驗檢測Rap2B基因被干擾后惡性轉(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞的遷移能力,RNAi-組和NC組平均間隙差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.739),而RNAi+組平均間隙與RNAi-組、NC組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P㩳0.001)。5.沉默Rap2B基因后細(xì)胞細(xì)胞凋亡和周期的變化RNAi+組細(xì)胞凋亡率與RNAi-組、NC組相比明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P㩳0.001),而RNAi-組和NC組的凋亡率相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.226);RNAi+組G1期細(xì)胞百分比與RNAi-組、NC組相比明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P㩳0.001)。S期細(xì)胞百分比與RNAi-組、NC組相比明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P㩳0.001)。G2/M期細(xì)胞百分比與RNAi-組、NC組相比明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P㩳0.001),而RNAi-組和NC組各期細(xì)胞百分比相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.820,P=923,P=0.791)。6.沉默Rap2B基因后p38、p65基因和蛋白的表達情況RNAi-組與NC組相比p38、p65基因m RNA表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.612,P=0.408),而RNAi+組p38、p65基因m RNA表達量均明顯低于RNAi-組和NC組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P㩳0.001);RNAi-組與NC組相比p38、p65蛋白表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.158,P=0.111),而RNAi+組p38、p65蛋白表達量均明顯低于RNAi-組和NC組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P㩳0.001)。結(jié)論沉默Rap2B基因被后,可以使p38、p65基因和蛋白相對表達量降低,從而抑制NF-κB通路和MAPK通路的活性,從而減弱細(xì)胞的增殖和遷移能力,促進細(xì)胞的凋亡,將細(xì)胞阻滯于G0/G1期,細(xì)胞分裂明顯減緩。
【關(guān)鍵詞】：苯并[α]芘 BEAS-2B細(xì)胞 RNAi NF-κB通路 MAPK通路
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-14
• Abbreviations table14-15
• 1 引言15-17
• 2 材料與方法17-32
• 2.1 材料17-21
• 2.1.1 實驗對象與受試物17
• 2.1.2 主要實驗儀器17-18
• 2.1.3 主要實驗試劑18-19
• 2.1.4 主要試劑配制19-21
• 2.2 實驗方法21-32
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)21-22
• 2.2.2 細(xì)胞染毒及惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞株的建立22
• 2.2.3 軟瓊脂克隆形成實驗22-23
• 2.2.4 BEAS-2B細(xì)胞RNAi處理23-25
• 2.2.5 RT-PCR分析25-27
• 2.2.6 RT-PCR檢測基因Rap2B、P38 和P65 的表達27
• 2.2.7 Western blot檢測Rap2B、P38 和P65 蛋白的表達27-30
• 2.2.8 細(xì)胞劃痕實驗測定細(xì)胞遷移能力30
• 2.2.9 MTT實驗30
• 2.2.10 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡30-31
• 2.2.11 統(tǒng)計分析31-32
• 3 結(jié)果32-47
• 3.1 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立32-33
• 3.1.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察32
• 3.1.2 軟瓊脂克隆形成實驗32-33
• 3.2 Rap2B在惡性轉(zhuǎn)BEAS-2B化細(xì)胞中的表達33-37
• 3.2.1 細(xì)胞總RNA純度及完整性測定結(jié)果33
• 3.2.2 熒光定量PCR檢測結(jié)果33-35
• 3.2.3 Western Blot檢測細(xì)胞蛋白結(jié)果35-37
• 3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率測定的結(jié)果37-38
• 3.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果37
• 3.3.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的結(jié)果37-38
• 3.4 Rap2B基因干擾效率的檢測結(jié)果38
• 3.5 軟瓊脂克隆形成實驗38-39
• 3.6 細(xì)胞劃痕實驗39-41
• 3.7 MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況41-42
• 3.8 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡和周期情況42-43
• 3.8.1 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡42
• 3.8.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期42-43
• 3.9 Rap2B基因干擾后對p38、p65 的影響43-47
• 3.9.1 熒光定量PCR檢測p38、p65 基因表達量結(jié)果43-45
• 3.9.2 Western Blot檢測細(xì)胞p38、p65 蛋白表達量45-47
• 4 討論47-52
• 4.1 BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的建立48
• 4.2 惡性轉(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞Rap2B基因和蛋白的表達48
• 4.3 干擾 Rap2B 基因后對細(xì)胞增殖和遷移能力的影響48-49
• 4.4 干擾Rap2B基因后對細(xì)胞增殖和遷移能力的影響49-50
• 4.5 Rap2B 基因干擾后對 p38、p65 基因和蛋白表達的影響50-52
• 5 結(jié)論52-53
• 參考文獻53-57
• 綜述 Rap2B基因的研究現(xiàn)狀57-70
• 1．Rap2B基因與肺癌57-59
• 2. Rap2B基因與MAPK通路59-61
• 2.1 MAPK信號通路與腫瘤的關(guān)系60
• 2.2 ＭＡＰＫ信號通路的基本組成60-61
• 2.3 P38 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤的關(guān)系61
• 3. Rap2B基因與NF-κB通路61-65
• 3.1 NF-κB通路與腫瘤62-63
• 3.2 NF-κB通路與惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)系63-64
• 3.3 NF-κB通路對凋亡的影響64
• 3.4 NF-κB通路對血管形成及轉(zhuǎn)移的作用64-65
• 4.結(jié)束語65-66
• 參考文獻66-70
• 個人簡歷在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果70-71
• 致謝71

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 姚琴;任明姬;趙鵬偉;;MAPK轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用[J];內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志;2014年10期

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本文編號：797002