本文關(guān)鍵詞：RNA干擾人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞KGF基因?qū)π叵偕掀ぜ?xì)胞增殖的體外研究

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【摘要】：目的:在血液科應(yīng)用放化療治療血液腫瘤成為最主要的治療途徑,但是化療及放療相關(guān)的胸腺損傷比較常見,有文獻(xiàn)報(bào)道,脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)胸腺的修復(fù),但是目前機(jī)制尚不能明確,但有文獻(xiàn)指出脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞可以分泌角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子,而這種因子可以與位于胸腺上皮細(xì)胞的受體結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)胸腺上皮的增殖,本實(shí)驗(yàn)旨在研究,在體外條件下,脂肪干細(xì)胞修復(fù)放化療損傷的胸腺的修復(fù)有可能是通過角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子實(shí)現(xiàn)的。方法:在無菌環(huán)境下分離提取人的皮下脂肪組織,應(yīng)用眼科剪將其剪碎至1mm3小組織塊,應(yīng)用I型膠原酶及胰蛋白酶對(duì)其進(jìn)行消化,制成單細(xì)胞懸液,按照一定細(xì)胞濃度分裝于若干培養(yǎng)瓶中,加入適量含有20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng),定期換液,觀察原代細(xì)胞形態(tài)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。首先篩選使KGF基因沉默的最佳siRNA序列。應(yīng)用si RNA target Designer設(shè)計(jì)軟件,選擇評(píng)分最高的交予銳博公司構(gòu)建KGF-siRNA-1、KGF-siRNA-2、KGF-siRNA-3、empty-si RNA四組siRNA,分別應(yīng)用Lipofectamine RNAiMAX瞬轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)染人的脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞,將轉(zhuǎn)染后的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞分為5組即KGF-siRNA-1組、KGF-siRNA-2組、KGF-siRNA-3組、empty-si RNA 4組以及空白對(duì)照組,有文獻(xiàn)指出在48小時(shí)后轉(zhuǎn)染效率最高,遂在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)良好,應(yīng)用QT—PCR篩選最佳序列。通過篩選,發(fā)現(xiàn)序列3(KGF-siRNA-3)沉默效率最佳,進(jìn)一步篩選KGF-siRNA-3使人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞基因沉默的最佳濃度,分別應(yīng)用Lipofectamine RNAi MAX瞬轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)染人的脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞,在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí),分為6組:組一:20umol/L、組二:30umol/L、組三:50 umol/L、組四:100umol/L、組五:空質(zhì)粒組、組六:空白對(duì)照組,、有文獻(xiàn)指出在48小時(shí)后轉(zhuǎn)染效率最高,遂在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)良好,應(yīng)用qt—pcr篩選最佳濃度。應(yīng)用western-blot檢測(cè)kgf基因沉默后48h及72h角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)。誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并通過brdu增殖實(shí)驗(yàn)對(duì)kgf基因沉默后的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將kgf基因沉默后的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞與人及小鼠的胸腺上皮細(xì)胞株在transwell小室進(jìn)行共培養(yǎng)(人脂肪源性干細(xì)胞位于小室的下層,胸腺上皮細(xì)胞位于小室上層)作為基因沉默組,將kgf基因正常表達(dá)的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞與人及小鼠的胸腺上皮細(xì)胞株在transwell小室進(jìn)行共培養(yǎng)(方法同前)作為基因正常表達(dá)組,同時(shí)設(shè)單純?nèi)思笆笮叵偕掀ぜ?xì)胞株培養(yǎng)組,應(yīng)用brdu增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定胸腺上皮細(xì)胞增殖,近一步通過pi(碘化丙啶)單染的方法分析胸腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期。結(jié)果:1培養(yǎng)人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞6-8d后,細(xì)胞呈比較典型的纖維狀,10-12d后鋪滿瓶底約90%左右。傳代后選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原cd44陽性率93.7%,cd34陽性率為0.405%。2qt—pcr結(jié)果顯示:與空質(zhì)粒組相比,轉(zhuǎn)染48小時(shí)kgf-sirna-1、kgf-sirna-2、kgf-sirna-3的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)kgfmrna水平分別下降了46.88%、30.12%、81.88%,其中kgf-sirna-3對(duì)kgfmrna的干擾作用最明顯(p0.05),而空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組比較,差異無顯著性(p0.05)。3進(jìn)一步篩選kgf-sirna-3使人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞基因沉默的最佳濃度,realtimepcr結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染48小時(shí)kgf-sirna-3(0.2ug)、kgf-sirna-3(0.3ug)、kgf-sirna-3(0.5ug)、kgf-sirna-3(1.0ug)的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞mrna水平分別下降了33.22%、46.40%、81.06%、42.35%,其中kgf-sirna-3(0.5ug)轉(zhuǎn)染組對(duì)kgfmrna表達(dá)干擾效果最明顯(p0.05),而空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組比較,差異無顯著性(p0.05)。4rna干擾kgf基因沉默后,48小時(shí)檢測(cè)角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá),在基因沉默組、空白對(duì)照組、空質(zhì)粒組分別為(0.223±0.007)、(0.881±0.009)、(0.894±0.004),空白對(duì)照組蛋白表達(dá)與空質(zhì)粒組無顯著性差異,p0.05,基因沉默組蛋白表達(dá)較空質(zhì)粒對(duì)照組下降76.17%,p0.05,。72小時(shí)在各組的表達(dá)為(0.184±0.008)、(0.916±0.006)、(0.931±0.005),空白對(duì)照組蛋白表達(dá)與空質(zhì)粒組無顯著性差異,p0.05,基因沉默組蛋白表達(dá)較空質(zhì)粒對(duì)照組下降80.24%,p0.05。5對(duì)基因沉默的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行鑒定,誘導(dǎo)成脂結(jié)果顯示誘導(dǎo)14天的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞油紅o染色陽性,應(yīng)用brdu方法測(cè)定結(jié)果顯示脂肪干細(xì)胞連續(xù)增殖。6應(yīng)用brdu增殖實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定基因沉默組,基因正常表達(dá)組及單純?nèi)诵叵偕掀ぜ?xì)胞株培養(yǎng)組胸腺上皮細(xì)胞增殖情況:第1天各組增殖情況為(24.6±0.7)%、(38.3±0.7)%、(18.6±0.5)%,第2天各組增殖情況為(34.8±0.6)%、(46.1±0.6)%、(28.9±0.3)%,第3天各組增殖情況為(40.6±0.5)%、(52.4±0.8)、(35.5±0.4)%,結(jié)果顯示基因正常表達(dá)組的增殖高于基因沉默組,p0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。7應(yīng)用brdu增殖實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定基因沉默組,基因正常表達(dá)組及單純鼠胸腺上皮細(xì)胞株培養(yǎng)組胸腺上皮細(xì)胞增殖情況:第1天各組增殖情況為(21.7±0.2)%、(36.8±0.6)%、(19.1±0.6)%第2天各組的增殖情況為(30.4±0.4)%、(45.8±0.7)%、(24.9±0.6)%第3天各組增殖情況為(35.9±0.7)%、(51.8±0.6)%、(31.5±0.3)%,結(jié)果顯示基因正常表達(dá)組的增殖高于基因沉默組,p0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。8應(yīng)用pi單染分別測(cè)定基因沉默組、基因正常表達(dá)組及單純?nèi)诵叵偕掀ぜ?xì)胞株培養(yǎng)組胸腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期,計(jì)算與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的s期細(xì)胞所占比例:第1天各組s期細(xì)胞所占比例為(24.6±0.7)%、(38.3±0.7)%、(18.6±0.5)%,第2天各組s期細(xì)胞所占比例為(34.8±0.6)%、(46.1±0.6)%、(28.9±0.3)%,第3天各組s期細(xì)胞所占比例為(40.6±0.5)%、(52.4±0.8)%、(35.5±0.4)%,結(jié)果顯示第1~3天,基因正常表達(dá)組的s期細(xì)胞所占比例均高于基因沉默組,p0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。9應(yīng)用pi單染分別測(cè)定基因沉默組、基因正常表達(dá)組及單純鼠胸腺上皮細(xì)胞株培養(yǎng)組胸腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期,計(jì)算與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的s期細(xì)胞所占比例:第1天各組s期細(xì)胞所占比例為(23.6±0.6)%、(37.3±0.7)%、(19.6±0.7)%,第2天各組S期細(xì)胞所占比例為(25.9±0.6)%、(45.1±0.6)%、(28.9±0.4)%,第3天各組S期細(xì)胞所占比例為(40.9±0.5)%、(53.4±0.8)%、(35.5±0.2)%,結(jié)果顯示第1~3天,基因正常表達(dá)組S期細(xì)胞所占比例均高于基因沉默組,P0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:1、脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)胸腺上皮細(xì)胞增殖,這種增殖作用可能是通過分泌角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子完成的2、脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)放化療損傷的胸腺可能存在修復(fù)作用。
【關(guān)鍵詞】：人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞 siRNA RNAi 角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子 基因沉默增殖
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.5
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-14
• 第一部分 脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定14-23
• 前言14-15
• 材料與方法15-18
• 結(jié)果18-19
• 附圖19-20
• 討論20-21
• 小結(jié)21-22
• 參考文獻(xiàn)22-23
• 第二部分 敲除人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞KGF基因?qū)π叵偕掀ぜ?xì)胞增殖的影響23-59
• 前言23-24
• 材料與方法24-36
• 結(jié)果36-38
• 附圖38-52
• 討論52-55
• 小結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 結(jié)論59-60
• 綜述 角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子研究進(jìn)展60-70
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 致謝70-71
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷71

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Protective effects of Rheum tanguticum polysaccharide against hydrogen peroxide-induced intestinal epithelial cell injury[J];World Journal of Gastroenterology;2005年10期

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本文編號(hào)：794642