本文關(guān)鍵詞：RNA干擾人脂肪源性間充質(zhì)干細胞KGF基因?qū)π叵偕掀ぜ毎鲋车捏w外研究

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【摘要】：目的:在血液科應(yīng)用放化療治療血液腫瘤成為最主要的治療途徑,但是化療及放療相關(guān)的胸腺損傷比較常見,有文獻報道,脂肪來源的間充質(zhì)干細胞可以促進胸腺的修復,但是目前機制尚不能明確,但有文獻指出脂肪源性間充質(zhì)干細胞可以分泌角質(zhì)細胞生長因子,而這種因子可以與位于胸腺上皮細胞的受體結(jié)合,進而促進胸腺上皮的增殖,本實驗旨在研究,在體外條件下,脂肪干細胞修復放化療損傷的胸腺的修復有可能是通過角質(zhì)細胞生長因子實現(xiàn)的。方法:在無菌環(huán)境下分離提取人的皮下脂肪組織,應(yīng)用眼科剪將其剪碎至1mm3小組織塊,應(yīng)用I型膠原酶及胰蛋白酶對其進行消化,制成單細胞懸液,按照一定細胞濃度分裝于若干培養(yǎng)瓶中,加入適量含有20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基于標準環(huán)境下進行培養(yǎng),定期換液,觀察原代細胞形態(tài)。應(yīng)用流式細胞術(shù)對干細胞進行鑒定。首先篩選使KGF基因沉默的最佳siRNA序列。應(yīng)用si RNA target Designer設(shè)計軟件,選擇評分最高的交予銳博公司構(gòu)建KGF-siRNA-1、KGF-siRNA-2、KGF-siRNA-3、empty-si RNA四組siRNA,分別應(yīng)用Lipofectamine RNAiMAX瞬轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)染人的脂肪源性間充質(zhì)干細胞,將轉(zhuǎn)染后的人脂肪源性間充質(zhì)干細胞分為5組即KGF-siRNA-1組、KGF-siRNA-2組、KGF-siRNA-3組、empty-si RNA 4組以及空白對照組,有文獻指出在48小時后轉(zhuǎn)染效率最高,遂在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時后觀察細胞生長良好,應(yīng)用QT—PCR篩選最佳序列。通過篩選,發(fā)現(xiàn)序列3(KGF-siRNA-3)沉默效率最佳,進一步篩選KGF-siRNA-3使人脂肪源性間充質(zhì)干細胞基因沉默的最佳濃度,分別應(yīng)用Lipofectamine RNAi MAX瞬轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)染人的脂肪源性間充質(zhì)干細胞,在標準培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時,分為6組:組一:20umol/L、組二:30umol/L、組三:50 umol/L、組四:100umol/L、組五:空質(zhì)粒組、組六:空白對照組,、有文獻指出在48小時后轉(zhuǎn)染效率最高,遂在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時后觀察細胞生長良好,應(yīng)用qt—pcr篩選最佳濃度。應(yīng)用western-blot檢測kgf基因沉默后48h及72h角質(zhì)細胞生長因子的表達。誘導脂肪間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞轉(zhuǎn)化,并通過brdu增殖實驗對kgf基因沉默后的脂肪間充質(zhì)干細胞進行鑒定。將kgf基因沉默后的人脂肪源性間充質(zhì)干細胞與人及小鼠的胸腺上皮細胞株在transwell小室進行共培養(yǎng)(人脂肪源性干細胞位于小室的下層,胸腺上皮細胞位于小室上層)作為基因沉默組,將kgf基因正常表達的人脂肪源性間充質(zhì)干細胞與人及小鼠的胸腺上皮細胞株在transwell小室進行共培養(yǎng)(方法同前)作為基因正常表達組,同時設(shè)單純?nèi)思笆笮叵偕掀ぜ毎昱囵B(yǎng)組,應(yīng)用brdu增殖實驗測定胸腺上皮細胞增殖,近一步通過pi(碘化丙啶)單染的方法分析胸腺上皮細胞的細胞周期。結(jié)果:1培養(yǎng)人脂肪源性間充質(zhì)干細胞6-8d后,細胞呈比較典型的纖維狀,10-12d后鋪滿瓶底約90%左右。傳代后選取對數(shù)生長期細胞,用流式細胞儀檢測細胞表面抗原cd44陽性率93.7%,cd34陽性率為0.405%。2qt—pcr結(jié)果顯示:與空質(zhì)粒組相比,轉(zhuǎn)染48小時kgf-sirna-1、kgf-sirna-2、kgf-sirna-3的人脂肪源性間充質(zhì)干細胞內(nèi)kgfmrna水平分別下降了46.88%、30.12%、81.88%,其中kgf-sirna-3對kgfmrna的干擾作用最明顯(p0.05),而空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組比較,差異無顯著性(p0.05)。3進一步篩選kgf-sirna-3使人脂肪源性間充質(zhì)干細胞基因沉默的最佳濃度,realtimepcr結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染48小時kgf-sirna-3(0.2ug)、kgf-sirna-3(0.3ug)、kgf-sirna-3(0.5ug)、kgf-sirna-3(1.0ug)的人脂肪源性間充質(zhì)干細胞mrna水平分別下降了33.22%、46.40%、81.06%、42.35%,其中kgf-sirna-3(0.5ug)轉(zhuǎn)染組對kgfmrna表達干擾效果最明顯(p0.05),而空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組比較,差異無顯著性(p0.05)。4rna干擾kgf基因沉默后,48小時檢測角質(zhì)細胞生長因子表達,在基因沉默組、空白對照組、空質(zhì)粒組分別為(0.223±0.007)、(0.881±0.009)、(0.894±0.004),空白對照組蛋白表達與空質(zhì)粒組無顯著性差異,p0.05,基因沉默組蛋白表達較空質(zhì)粒對照組下降76.17%,p0.05,。72小時在各組的表達為(0.184±0.008)、(0.916±0.006)、(0.931±0.005),空白對照組蛋白表達與空質(zhì)粒組無顯著性差異,p0.05,基因沉默組蛋白表達較空質(zhì)粒對照組下降80.24%,p0.05。5對基因沉默的脂肪干細胞進行鑒定,誘導成脂結(jié)果顯示誘導14天的人脂肪源性間充質(zhì)干細胞油紅o染色陽性,應(yīng)用brdu方法測定結(jié)果顯示脂肪干細胞連續(xù)增殖。6應(yīng)用brdu增殖實驗分別測定基因沉默組,基因正常表達組及單純?nèi)诵叵偕掀ぜ毎昱囵B(yǎng)組胸腺上皮細胞增殖情況:第1天各組增殖情況為(24.6±0.7)%、(38.3±0.7)%、(18.6±0.5)%,第2天各組增殖情況為(34.8±0.6)%、(46.1±0.6)%、(28.9±0.3)%,第3天各組增殖情況為(40.6±0.5)%、(52.4±0.8)、(35.5±0.4)%,結(jié)果顯示基因正常表達組的增殖高于基因沉默組,p0.05,有統(tǒng)計學差異。7應(yīng)用brdu增殖實驗分別測定基因沉默組,基因正常表達組及單純鼠胸腺上皮細胞株培養(yǎng)組胸腺上皮細胞增殖情況:第1天各組增殖情況為(21.7±0.2)%、(36.8±0.6)%、(19.1±0.6)%第2天各組的增殖情況為(30.4±0.4)%、(45.8±0.7)%、(24.9±0.6)%第3天各組增殖情況為(35.9±0.7)%、(51.8±0.6)%、(31.5±0.3)%,結(jié)果顯示基因正常表達組的增殖高于基因沉默組,p0.05,有統(tǒng)計學差異。8應(yīng)用pi單染分別測定基因沉默組、基因正常表達組及單純?nèi)诵叵偕掀ぜ毎昱囵B(yǎng)組胸腺上皮細胞的細胞周期,計算與細胞增殖密切相關(guān)的s期細胞所占比例:第1天各組s期細胞所占比例為(24.6±0.7)%、(38.3±0.7)%、(18.6±0.5)%,第2天各組s期細胞所占比例為(34.8±0.6)%、(46.1±0.6)%、(28.9±0.3)%,第3天各組s期細胞所占比例為(40.6±0.5)%、(52.4±0.8)%、(35.5±0.4)%,結(jié)果顯示第1~3天,基因正常表達組的s期細胞所占比例均高于基因沉默組,p0.05,有統(tǒng)計學差異。9應(yīng)用pi單染分別測定基因沉默組、基因正常表達組及單純鼠胸腺上皮細胞株培養(yǎng)組胸腺上皮細胞的細胞周期,計算與細胞增殖密切相關(guān)的s期細胞所占比例:第1天各組s期細胞所占比例為(23.6±0.6)%、(37.3±0.7)%、(19.6±0.7)%,第2天各組S期細胞所占比例為(25.9±0.6)%、(45.1±0.6)%、(28.9±0.4)%,第3天各組S期細胞所占比例為(40.9±0.5)%、(53.4±0.8)%、(35.5±0.2)%,結(jié)果顯示第1~3天,基因正常表達組S期細胞所占比例均高于基因沉默組,P0.05,有統(tǒng)計學差異。結(jié)論:1、脂肪源性間充質(zhì)干細胞可以促進胸腺上皮細胞增殖,這種增殖作用可能是通過分泌角質(zhì)細胞生長因子完成的2、脂肪源性間充質(zhì)干細胞對放化療損傷的胸腺可能存在修復作用。
【關(guān)鍵詞】：人脂肪源性間充質(zhì)干細胞 siRNA RNAi 角質(zhì)細胞生長因子 基因沉默增殖
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-14
• 第一部分 脂肪干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定14-23
• 前言14-15
• 材料與方法15-18
• 結(jié)果18-19
• 附圖19-20
• 討論20-21
• 小結(jié)21-22
• 參考文獻22-23
• 第二部分 敲除人脂肪源性間充質(zhì)干細胞KGF基因?qū)π叵偕掀ぜ毎鲋车挠绊?/span>23-59
• 前言23-24
• 材料與方法24-36
• 結(jié)果36-38
• 附圖38-52
• 討論52-55
• 小結(jié)55-56
• 參考文獻56-59
• 結(jié)論59-60
• 綜述 角質(zhì)細胞生長因子研究進展60-70
• 參考文獻66-70
• 致謝70-71
• 個人簡歷71

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Protective effects of Rheum tanguticum polysaccharide against hydrogen peroxide-induced intestinal epithelial cell injury[J];World Journal of Gastroenterology;2005年10期

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本文編號：794642