本文關(guān)鍵詞：HDAC1異常表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥程度的影響

  更多相關(guān)文章： HDAC1 慢病毒 膠質(zhì)瘤 過表達(dá) 下調(diào) 耐藥性

【摘要】：腦膠質(zhì)瘤是位于大腦和脊髓膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生癌變后所產(chǎn)生的原發(fā)性顱腦腫瘤,是神經(jīng)外科常見惡性腫瘤。化學(xué)藥物治療是膠質(zhì)瘤患者手術(shù)切除后的重要手段,但因其生長部位具有特殊性以及血腦屏障的作用而嚴(yán)重影響化療效果,膠質(zhì)瘤耐藥性極強(qiáng)等,是膠質(zhì)瘤化療失敗的主要原因。因此研究化療藥耐藥相關(guān)作用機(jī)制,尋找耐藥相關(guān)靶點(diǎn)對(duì)臨床治療有指導(dǎo)意義。HDAC1屬于第一類組蛋白去乙�；�,與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬建立HDAC1過表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞株,觀察不同水平的HDAC1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG耐藥程度的影響,并探討其作用機(jī)制,進(jìn)一步為提高膠質(zhì)瘤化療藥敏感性奠定基礎(chǔ)。目的:探討組蛋白去乙�；窰DAC1過表達(dá)及低表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤化療藥耐藥程度的影響及其作用機(jī)制。方法:第一部分:1.HDAC1穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株U87MG-HDAC1的建立從膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞中提取總RNA,經(jīng)過RT-PCR反應(yīng),TA克隆,酶切鑒定及基因序列分析鑒定,回收純化HDAC1基因片段,將HDAC1片段與空載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro連接得連接產(chǎn)物pCDH-CMV-MCS-HDAC1-EF1-Puro,轉(zhuǎn)化stbl3感受態(tài)細(xì)胞后提取質(zhì)粒,細(xì)胞293T包裝病毒,感染U87MG細(xì)胞,嘌呤霉素篩選,Western Blot免疫印跡法測(cè)定HDAC1表達(dá)量,建立HDAC1穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株U87MG-HDAC1及其陰性對(duì)照U87MG-Control。2.HDAC1低表達(dá)細(xì)胞株U87MG-HDAC1-RNAi的建立針對(duì)HDAC1目的序列,按照shRNA要求合成oligo DNA,經(jīng)退火反應(yīng)形成雙鏈,與GV-248載體進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒提取,293T細(xì)胞包裝病毒,感染膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞,嘌呤霉素篩選,Western Blot免疫印跡法測(cè)定HDAC1表達(dá)量,建立HDAC1穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞株U87MG-HDAC1-RNAi及其陰性對(duì)照U87MG-NC-RNAi。第二部分:HDAC1過表達(dá)和低表達(dá)對(duì)化療藥耐藥程度的影響將實(shí)驗(yàn)對(duì)象分為hdac1過表達(dá)組(u87mg-hdac1u87mg-control)和hdac1低表達(dá)組(u87mg-hdac1-rnaiu87mg-nc-rnai)。分別用vm-26和ddp兩類藥物處理兩組細(xì)胞。vm-26藥物作用終濃度分別為:0.1、0.5、2.5和12.5μg/ml;ddp藥物作用終梯度濃度分別為:0.08、0.4、2和10μg/ml。藥物vm-26或ddp作用細(xì)胞48h后,mtt法分別檢測(cè)過表達(dá)組和下調(diào)組細(xì)胞存活率的改變;hoechst/pi雙染法檢兩組凋亡形態(tài)學(xué)變化,westernblot檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白bax、caspase-3和bcl-2表達(dá)情況。結(jié)果:第一部分:1.正確擴(kuò)增hdac1基因編碼區(qū)并包裝過表達(dá)慢病毒載體pcdh-cmv-mcs-hdac1-ef1-puro,建立hdac1穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株,westernblot結(jié)果顯示u87mg-hdac1組中hdac1蛋白的表達(dá)較u87mg-control組顯著增加(1.148±0.024vs0.580±0.003,p0.01)。2.正確設(shè)計(jì)合成hdac1shrna雙鏈結(jié)構(gòu)并包裝低表達(dá)慢病毒載體gv248-hdac1-rnai,建立hdac1穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞株u87mg-hdac1-rnai,westernblot結(jié)果顯示u87mg-hdac1-rnai組中hdac1蛋白的表達(dá)較u87mg-nc-rnai組顯著下調(diào)(0.705±0.009vs0.352±0.006,p0.01)。第二部分:hdac1的過表達(dá)和低表達(dá)對(duì)藥物處理后耐藥程度的影響mtt細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,vm-26和ddp兩種藥物分別處理后,過表達(dá)組(u87mg-hdac1u87mg-control)兩細(xì)胞株存活率均呈濃度依懶性地降低;在相同的vm-26或ddp各個(gè)濃度,u87mg-hdac1存活率顯著高于u87mg-control細(xì)胞株(p0.05);vm-26作用下u87mg-hdac1的ic50值是u87mg-control的3.11倍,ddp作用下u87mg-hdac1的ic50值是u87mg-control的2.60倍。vm-26和ddp兩藥物分別處理后,低表達(dá)組(u87mg-hdac1-rnaiu87mg-nc-rnai)兩株細(xì)胞存活率均隨藥物濃度增大而降低;在同一vm-26或ddp濃度下,u87mg-hdac1-rnai存活率明顯低于u87mg-nc-rnai細(xì)胞株(p0.05);vm-26作用下u87mg-hdac1-rnai的ic50值是u87mg-nc-rnai的0.49倍,ddp作用下u87mg-hdac1-rnai的ic50值是u87mg-nc-rnai的0.62倍。hoechst33258/pi雙染法觀察,vm-26和ddp兩種藥物處理后,過表達(dá)組(U87MG-HDAC1U87MG-Control)兩細(xì)胞株均隨濃度增大,凋亡細(xì)胞比例增大;在相同的VM-26或DDP各個(gè)濃度下,U87MG-HDAC1細(xì)胞株凋亡細(xì)胞比例顯著低于U87MG-Control。VM-26和DDP兩種藥物處理后,低表達(dá)組(U87MG-HDAC1-RNAiU87MG-NC-RNAi)兩細(xì)胞株均隨濃度增大,凋亡細(xì)胞比例增大;在相同的VM-26或DDP各個(gè)濃度下,U87MG-HDAC1-RNAi細(xì)胞株凋亡細(xì)胞比例顯著高于U87MG-Control-RNAi。Western blot免疫印跡結(jié)果顯示,VM-26和DDP兩種藥物處理后,過表達(dá)組(U87MG-HDAC1U87MG-Control)兩細(xì)胞株,隨藥物濃度增大,Bax、Caspase-3隨之增大,Bcl-2表達(dá)則降低;在相同的VM-26或DDP各個(gè)濃度下,U87MG-HDAC1的Bcl-2/Bax值顯著高于U87MG-Control(P0.05),而Caspase3表達(dá)量顯著低于U87MG-Control(P0.05)。VM-26和DDP兩種藥物處理后,低表達(dá)組(U87MG-HDAC1-RNAiU87MG-NC-RNAi)兩細(xì)胞株,隨藥物濃度增大,Bax、Caspase-3表達(dá)均增強(qiáng),Bcl-2則降低;在相同的VM-26或DDP各個(gè)濃度下,U87MG-HDAC1-RNAi的Bcl-2/Bax值顯著低于U87MG-NC-RNAi(P0.05),而Caspas-3表達(dá)量顯著高于U87MG-NC-RNAi(P0.05)。結(jié)論:1.成功構(gòu)建HDAC1穩(wěn)定細(xì)胞株U87MG-HDAC1及其陰性對(duì)照U87MG-Control。2.成功構(gòu)建HDAC1穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞株U87MG-HDAC1-RNAi及其陰性對(duì)照U87MG-NC-RNAi。3.HDAC1過表達(dá)與低表達(dá),導(dǎo)致化療藥物處理后細(xì)胞耐藥性的增強(qiáng)或減弱,與Bax/Bcl-2的比值及Caspase-3的表達(dá)量密切相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：HDAC1 慢病毒 膠質(zhì)瘤 過表達(dá) 下調(diào) 耐藥性
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語12-14
• 前言14-17
• 研究現(xiàn)狀、成果14-16
• 研究目的、方法16-17
• 一、HDAC1穩(wěn)定過表達(dá)和低表達(dá)U87MG細(xì)胞株的構(gòu)建17-47
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料17-28
• 1.1.1 質(zhì)粒17-20
• 1.1.2 細(xì)胞和菌株20
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與材料20-21
• 1.1.4 試劑與藥品21-24
• 1.1.5 溶液配制24-28
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法28-40
• 1.2.1 HDAC1過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建實(shí)驗(yàn)流程28-38
• 1.2.2 HDAC1下調(diào)細(xì)胞株構(gòu)建實(shí)驗(yàn)流程38-40
• 1.2.3 數(shù)據(jù)處理40
• 1.3 結(jié)果40-43
• 1.3.1 HDAC1基因PCR產(chǎn)物的回收40
• 1.3.2 pCDH-CMV-MCS-HDAC1-EF1-Puro重組質(zhì)粒的酶切鑒定及測(cè)序40-41
• 1.3.3 Western Blot檢測(cè)HDAC1過表達(dá)結(jié)果41-42
• 1.3.4 GV248-HDAC1-RNAi陽性克隆測(cè)序結(jié)果42
• 1.3.5 慢病毒GV248-HDAC1-RNAi轉(zhuǎn)染后熒光強(qiáng)度42
• 1.3.6 Western Blot法檢測(cè)HDAC1下調(diào)結(jié)果42-43
• 1.4 小結(jié)43
• 1.5 討論43-47
• 二、HDAC1過表達(dá)和低表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤化療藥物耐藥性的影響47-66
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料47-48
• 2.1.1 細(xì)胞47
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與耗材47
• 2.1.3 藥品與試劑47
• 2.1.4 主要溶液配制47-48
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法48-49
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組48
• 2.2.2 MTT法檢測(cè)藥物敏感性48
• 2.2.3 Hoechst 33258/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡48-49
• 2.2.4 Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白49
• 2.2.5 數(shù)據(jù)處理49
• 2.3 結(jié)果49-60
• 2.3.1 細(xì)胞藥物敏感性的改變49-53
• 2.3.2 細(xì)胞形態(tài)的改變53-57
• 2.3.3 凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)結(jié)果57-60
• 2.4 小結(jié)60-61
• 2.5 討論61-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-75
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明75-76
• 綜述 HDAC1及其抑制劑在細(xì)胞中的作用76-85
• 綜述參考文獻(xiàn)81-85
• 致謝85-86
• 個(gè)人簡歷86

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本文編號(hào)：790236