本文關(guān)鍵詞：抗人胃癌干細(xì)胞功能性單抗的研究

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【摘要】：第一部分抗人胃癌干細(xì)胞功能性單抗的篩選鑒定胃癌在我國發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的第二位,一直對人類生命健康造成嚴(yán)重威脅。導(dǎo)致胃癌高死亡率的根本原因是手術(shù)、放療、化療后仍發(fā)生高比例的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā),且發(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的胃癌幾乎都耐藥。然而,現(xiàn)有的臨床治療手段對轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)后的胃癌療效甚微,胃癌死亡率多年來仍舊居高不下。近年來,有關(guān)腫瘤干細(xì)胞的最新研究表明,腫瘤干細(xì)胞是造成腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥的根本原因。因此,靶向腫瘤干細(xì)胞治療腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥的新策略,有望降低腫瘤死亡率,成為當(dāng)今腫瘤研究的新熱點。目前尚未見到有關(guān)靶向胃癌干細(xì)胞治療的研究報道。本課題研究旨在篩選鑒定獲得能靶向胃癌干細(xì)胞的功能性單抗,通過體內(nèi)、外功能研究證明功能性抗體靶向胃癌干細(xì)胞能有效治療胃癌,從而為治療胃癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥提供有應(yīng)用價值的后續(xù)抗體前藥。本實驗在前期研究中,從人胃癌組織中分離含有腫瘤干細(xì)胞的胃癌細(xì)胞,免疫小鼠后,采用本室建立的大容量功能性單抗庫技術(shù)制備了庫容3120個克隆的雜交瘤單抗庫。在此基礎(chǔ)上,本研究首先采用活細(xì)胞ELISA技術(shù)篩選該單抗庫3120個克隆的雜交瘤上清,獲得了482株能同時與胃癌細(xì)胞SNU-5和BGC-823兩種胃癌細(xì)胞膜反應(yīng)陽性的雜交瘤克隆。為了獲得抗人胃癌干細(xì)胞的單抗,采用含腫瘤干細(xì)胞比例高的SNU-5 Sphere細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞ELISA法復(fù)篩482株陽性單抗,結(jié)果顯示其中144株單抗上清與SNU-5 Sphere細(xì)胞的結(jié)合反應(yīng)的OD值(0.5-1.2)顯著高于親本細(xì)胞(0.2～0.4),表明這些單抗可能是抗人胃癌干細(xì)胞單抗。為了進(jìn)一步確定這些單抗是抗人胃癌干細(xì)胞單抗,我們采用無血清甲基纖維素成球抑制實驗檢測了144株單抗能否抑制腫瘤干細(xì)胞自我更新能力的成球生長的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn),其中64株單抗能不同程度地抑制SNU-5中腫瘤干細(xì)胞的成球生長,抑制率達(dá)10-52%,證明這64株單抗不僅是抗人胃癌干細(xì)胞的單抗,而且可能是還具有抑制胃癌干細(xì)胞功能的功能性單抗。為了進(jìn)一步驗證64株單抗是抗人胃癌干細(xì)胞的功能性單抗,我們從64株候選單抗中挑選了10株單抗在2種胃癌干細(xì)胞模型中,采用流式活細(xì)胞免疫熒光、無血清甲基纖維素成球抑制、活細(xì)胞ELISA單抗技術(shù)進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),10株單抗的陽性細(xì)胞在胃癌Sphere細(xì)胞中的比例升高,均有不同程度富集,表明這些單抗具有腫瘤干細(xì)胞自我更新能力。同時發(fā)現(xiàn)10株單抗與胃癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD90、CD44陽性的胃癌干細(xì)胞均有不同比例的共染,且共染陽性細(xì)胞的比例在Sphere細(xì)胞中都明顯富集(1.3-31.4倍),表明10株單抗均能識別人胃癌干細(xì)胞并與之呈陽性反應(yīng),證實這些單抗都是抗人胃癌干細(xì)胞的單抗。成球抑制實驗結(jié)果表明10株單抗對2種胃癌細(xì)胞的干細(xì)胞均有不同程度的抑制作用,抑制率達(dá)16.3-45.2%。是具有功能的胃癌干細(xì)胞單抗。至此,我們至少篩選鑒定獲得10株抗胃癌干細(xì)胞的功能性單抗。第二部分抗人胃癌干細(xì)胞單抗25G5的研究在前面10株抗人胃癌干細(xì)胞單抗研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn),其中單抗25G5在胃癌Sphere細(xì)胞中的陽性比例高(17.1%),富集倍數(shù)也高,與人胃癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD90、CD44共染比例最高、富集比例最高(31.4倍)。抑制人胃癌干細(xì)胞成球的功能性也最好(抑制率達(dá)31.3～45.2%),這些結(jié)果表明25G5單抗在10株單抗中,腫瘤干細(xì)胞特性最強,抑制胃癌干細(xì)胞功能最強。因此,我們選擇25G5單抗進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞特性、體外功能及體內(nèi)靶向人胃癌干細(xì)胞治療胃癌的系統(tǒng)研究。通過無血清擴大培養(yǎng)25G5單抗雜交瘤,收集上清,采用Protein G親和純化法,從無血清上清中純化25G5單抗。首先,我們對25G5單抗識別結(jié)合的陽性細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性進(jìn)行了檢測分析。已有的研究證明腫瘤干細(xì)胞具有很強的自我更新、高侵襲、耐藥能力以及體內(nèi)高致瘤性等特征。采用雙色活細(xì)胞免疫熒光檢測,發(fā)現(xiàn)25G5單抗識別的抗原與人胃癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD90、CD44均共表達(dá)共定位于人胃癌干細(xì)胞膜上,證明25G5單抗是抗人胃癌干細(xì)胞單抗。采用流式分選技術(shù),分選25G5+、25G5-和假分選細(xì)胞,檢測分析在無血清培養(yǎng)基的成球率表明,25G5-細(xì)胞的成球率(21.4%)顯著高于25G5-細(xì)胞(12.3%)和親本細(xì)胞(16.1%),P值0.05,表明25G5單抗陽性細(xì)胞具有較強的腫瘤干細(xì)胞自我更新能力。用流式分選細(xì)胞進(jìn)行的Transwell細(xì)胞侵襲實驗、耐藥實驗,結(jié)果表明,25G5+細(xì)胞的侵襲能力(244.5)較25G5”細(xì)胞(122.4)和親本細(xì)胞(143.2)顯著增強。25G5+細(xì)胞對順鉑化療藥的耐藥性(IC50 0.285μg/ml)較25G5-細(xì)胞(IC50 0.094μg/ml)和親本細(xì)胞(IC50 0.155μg/ml)顯著升高。鑒于腫瘤干細(xì)胞體內(nèi)高致瘤性是評價腫瘤干細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn),我們將細(xì)胞接種裸鼠體內(nèi)觀察其致瘤性,發(fā)現(xiàn)25G5-細(xì)胞的致瘤性較25G5-細(xì)胞高50倍以上,較親本細(xì)胞高25倍以上。以上這些研究結(jié)果證明25G5單抗識別的細(xì)胞是人胃癌干細(xì)胞,具有腫瘤干細(xì)胞的所有特征。即25G5是識別人胃癌干細(xì)胞的單抗。采用無血清甲基纖維素成球抑制,Transwell細(xì)胞侵襲和細(xì)胞耐藥等實驗在兩種人胃癌干細(xì)胞模型中系統(tǒng)研究了25G5單抗的體外功能。結(jié)果顯示,25G5單抗在0.125mg/ml-2mg/ml的抗體濃度下對SNU-5細(xì)胞中干細(xì)胞的成球生長均有抑制作用,其抑制率為22.8～46.4%(P0.05),且有明顯的抗體劑量依賴關(guān)系。同樣對BGC-823胃癌細(xì)胞中的干細(xì)胞的成球生長抑制率為17.542.5%。表明25G5具有顯著抑制胃癌干細(xì)胞自我更新能力的功能。Transwell侵襲實驗的結(jié)果顯示,25G5單抗對含有高比例胃癌干細(xì)胞的SNU-5的Sphere細(xì)胞的侵襲功能有明顯的抑制作用,抑制率為26.658.4%(P0.05)。細(xì)胞耐藥實驗的結(jié)果顯示,25G5單抗能顯著降低人胃癌干細(xì)胞的耐藥性,且有明顯抗體劑量相關(guān)性,在抗體濃度達(dá)到1mg/ml時,干細(xì)胞的耐藥性下降約1.3倍(IC50值由0.341 μg/ml下降至0.153μg/ml)。以上這些結(jié)果證明25G5單抗能顯著抑制人胃癌干細(xì)胞的自我更新、侵襲和耐藥的功能,是一株抗人胃癌干細(xì)胞的功能性單抗。為了探討25G5單抗在體內(nèi)靶向胃癌干細(xì)胞能否有效治療人胃癌,我們用純化的25G5單抗進(jìn)行體內(nèi)靶向裸鼠移植瘤的動物試驗研究,為了科學(xué)評價結(jié)果,我們首先建立了適合25G5單抗的含有高比例胃癌干細(xì)胞的自發(fā)性高肺轉(zhuǎn)移的動物模型SNU-5-V13。將SNU-5-V13的Sphere細(xì)胞接種裸鼠前肢腋下的皮下后,再經(jīng)腹腔注射25G5抗體藥物進(jìn)行治療。動物試驗設(shè)9組,每周治療2次,共計治療10次。其間觀察測定記錄腫瘤體積描繪腫瘤生長曲線,計算腫瘤生長體積的抑制率和P值。綜上所述,本研究從3120個克隆的胃癌單抗雜交瘤庫中篩選獲得了64株抗人胃癌干細(xì)胞單抗,初步證明有10株單抗是具有抑制胃癌干細(xì)胞功能的功能性單抗,挑選其中的1株單抗25G5進(jìn)行的系統(tǒng)性研究證明,25G5單抗識別的陽性細(xì)胞具有較強胃癌干細(xì)胞干性特征,確實是一株抗人胃癌干細(xì)胞的單抗,同時該單抗還能顯著地抑制胃癌干細(xì)胞的自我更新、高侵襲、高耐藥的體外功能,體內(nèi)靶向胃癌干細(xì)胞能有效治療小鼠的人胃癌移植瘤,具有開發(fā)為靶向胃癌干細(xì)胞治療胃癌的抗體靶向藥物的應(yīng)用潛力。
【關(guān)鍵詞】：人胃癌細(xì)胞 腫瘤干細(xì)胞 單克隆抗體 靶向治療
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 個人簡歷3-7
• 摘要7-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-17
• 第一部分：抗人胃癌干細(xì)胞功能性單抗的篩選17-45
• 一、實驗材料與方法17-26
• 二、研究設(shè)計與技術(shù)路線26-27
• 三、實驗結(jié)果27-44
• (一) 人胃癌干細(xì)胞細(xì)胞系模型的篩選27-31
• 1. 4種人胃癌細(xì)胞系無血清培養(yǎng)成球率分析27
• 2. 流式細(xì)胞術(shù)檢測胃癌干細(xì)胞標(biāo)志物27-29
• 3 PKH26染色確認(rèn)人胃癌細(xì)胞系中存在腫瘤干細(xì)胞29-31
• (二) 人胃癌單抗庫的制備及篩選31-44
• 1 人胃癌單抗庫的制備31
• 2 人胃癌單抗庫的初篩31-32
• 2.1 SNU-5活細(xì)胞ELISA篩選胃癌細(xì)胞陽性單抗31
• 2.2 BGC-823活細(xì)胞ELISA篩選胃癌細(xì)胞陽性單抗31-32
• 3 人胃癌干細(xì)胞陽性單抗的篩選32-33
• 3.1 Sphere細(xì)胞篩選胃癌干細(xì)胞單抗32
• 3.2 成球抑制實驗篩選胃癌干細(xì)胞功能性單抗32-33
• 4 10株胃癌干細(xì)胞功能性單抗的進(jìn)一步鑒定33-44
• 4.1 10株單抗類和亞類及分泌表達(dá)量的測定33-34
• 4.2 活細(xì)胞ELISA檢測10株單抗與胃癌細(xì)胞系中結(jié)合反應(yīng)34-35
• 4.3 流式檢測單抗陽性細(xì)胞在SNU-5Sphere細(xì)胞中富集35-36
• 4.4 流式檢測單抗陽性細(xì)胞BGC-823Sphere細(xì)胞中富集36-38
• 4.5 10株單抗與胃癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD90的共染分析38-40
• 4.6 10株單抗與胃癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD44共染分析40-41
• 4.7 10株單抗對胃癌干細(xì)胞成球生長的抑制作用41-43
• 4.8 WB分析10株單抗與胃癌干細(xì)胞中抗原結(jié)合的特異性43-44
• 第一部分小結(jié)44-45
• 第二部分：抗人胃癌干細(xì)胞單抗25G5的研究45-76
• 一、實驗材料與方法45-57
• 二、研究設(shè)計與技術(shù)路線57-58
• 三、實驗結(jié)果58-75
• (一) 25G5單抗雜交瘤的培養(yǎng)及抗體純化58-59
• 1 單抗雜交瘤細(xì)胞的無血清擴大培養(yǎng)及上清收集58
• 2 25G5單抗的純化、純度及活性鑒定58-59
• (二) 25G5單抗識別細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性的鑒定59-65
• 1 25G5單抗與標(biāo)志物在胃癌干細(xì)胞膜上共定位分析59-60
• 2 25G5單抗識別的陽性細(xì)胞具有腫瘤噶細(xì)胞自我更新能力60-62
• 3 25G5單抗識別的陽性細(xì)胞具有更強的侵襲能力62-63
• 4 25G5單抗識別的陽性細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞高耐藥性特征63-64
• 5 25G5單抗識別的陽性細(xì)胞具有在體內(nèi)的高致瘤性特征64-65
• (三) 單抗25G5體外功能的研究65-70
• 1 單抗25G5對胃癌干細(xì)胞自我更新能力的影響65-66
• 2 單抗25G5對胃癌干細(xì)胞細(xì)胞侵襲能力的影響66-68
• 3 單抗25G5降低胃癌干細(xì)胞對順鉑化療藥的耐藥性68-70
• (四) 單抗25G5靶向胃癌干細(xì)胞治療胃癌的動物體內(nèi)試驗研究70-75
• 1 靶向胃癌干細(xì)胞治療胃癌體內(nèi)試驗動物模型的研究70-74
• 1.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測SNU-5-V13中25G5~+干細(xì)胞的存在70-71
• 1.2 單抗25G5對SNU-5-V13體外自我更新能力的影響71-72
• 1.3 SNU-5-V13細(xì)胞系裸鼠移植瘤模型的建立72-74
• 2 單抗25G5靶向胃癌干細(xì)胞治療胃癌的動物體內(nèi)試驗74-75
• 第二部分小結(jié)75-76
• 討論76-80
• 結(jié)論80-81
• 參考文獻(xiàn)81-83
• 中英文縮略表83-84
• 綜述84-91
• 參考文獻(xiàn)88-91
• 致謝91-93
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文93

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10 劉龔玫子;周，

本文編號：786820