本文關(guān)鍵詞：Irx5過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株的構(gòu)建及其細(xì)胞功能分析

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【摘要】：Irx5(Iroquois homeobox gene family)基因是伊洛魁同源盒基因家族中的一員,該家族有6個(gè)成員。有報(bào)道表明Irx家族的一些成員與人多種腫瘤的發(fā)生有關(guān),其中Irx1和Irx4已被證實(shí)分別是胃癌和前列腺癌轉(zhuǎn)移的抑制基因;而Irx5基因在人、鼠高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系中均低表達(dá),且其表達(dá)水平與乳腺癌患者癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力呈明顯負(fù)相關(guān),暗示Irx5可能是一個(gè)乳腺癌轉(zhuǎn)移的抑制基因。為了進(jìn)一步研究Irx5基因在乳腺癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中的作用。我們構(gòu)建了Irx5基因過表達(dá)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞株,利用細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等體外實(shí)驗(yàn)確認(rèn)Irx5基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用。研究結(jié)果如下:(1)根據(jù)GenBank中人Irx5基因序列(NM_005853),設(shè)計(jì)一對引物,采用RT-PCR從293T細(xì)胞的cDNA中成功擴(kuò)增出Irx5基因的編碼區(qū)序列;純化后的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI和BamHI雙酶切后,與同樣酶切線性化的慢病毒載體(PEB-3xflag-GP)連接,獲得重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒(PEB-3xflag-GP-Irx5);經(jīng)酶切、電泳檢測、測序后發(fā)現(xiàn)重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒(PEB-3xflag-GP-Irx5)中的插入片段與GenBank中Irx5基因編碼區(qū)序列完全一致,表明重組過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。(2)將成功構(gòu)建的重組慢病毒質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,生產(chǎn)重組慢病毒,病毒懸液梯度稀釋法測得病毒滴度為3~8×108 TU/mL;用病毒感染高轉(zhuǎn)移的人MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞。感染48 h后用2.5μg/m L嘌呤霉素篩選穩(wěn)定過表達(dá)Irx5基因的細(xì)胞株,經(jīng)2~3周的篩選,Western blotting法檢測了Irx5基因在細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示用重組慢病毒感染的乳腺癌細(xì)胞中有外源Irx5基因的過表達(dá),而用空載體病毒感染(對照)的乳腺癌細(xì)胞中無外源Irx5基因的表達(dá),說明已成功構(gòu)建了Irx5基因過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株,Irx5基因在乳腺癌細(xì)胞中可以穩(wěn)定表達(dá)。(3)通過MTT、克隆形成、細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)研究了Irx5基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵潤能力的影響。與對照細(xì)胞相比,MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Irx5基因過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞增殖能力下降;細(xì)胞劃痕和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中Irx5基因過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞遷移能力降低;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中Irx5基因過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞侵襲能力降低;由此說明Irx5過表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。Irx5基因這一抑制作用的證實(shí),不僅為進(jìn)一步闡明其分子機(jī)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)通路奠定了基礎(chǔ),而且為轉(zhuǎn)移性乳腺癌的分子診斷、個(gè)體化治療和靶向藥物治療等提供了一個(gè)新的思路。
【關(guān)鍵詞】：Irx5基因 慢病毒載體 遷移 侵潤 基因過表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：淮北師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 緒論11-19
• 1.1 乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究進(jìn)展11-19
• 1.1.1 乳腺癌轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因12-14
• 1.1.2 乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因14-16
• 1.1.3 乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制16-19
• 第二章 Irx5過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株的構(gòu)建19-39
• 2.1 材料19-21
• 2.1.1 載體和細(xì)胞19-20
• 2.1.2 儀器20
• 2.1.3 主要試劑20-21
• 2.2 方法21-33
• 2.2.1 Irx5過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株的篩選流程21
• 2.2.2 Irx5基因重組慢病毒載體構(gòu)建21-27
• 2.2.3 慢病毒包裝27-30
• 2.2.4 Irx5過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株的篩選30-33
• 2.3 結(jié)果與分析33-37
• 2.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果33
• 2.3.2 菌落PCR鑒定結(jié)果33-34
• 2.3.3 重組慢病毒載體陽性克隆雙酶切結(jié)果34-35
• 2.3.4 陽性克隆測序結(jié)果35-36
• 2.3.5 慢病毒滴度測定36-37
• 2.3.6 Western blotting檢測外源Irx5基因表達(dá)的結(jié)果37
• 2.4 小結(jié)37-38
• 2.5 討論38-39
• 第三章 Irx5基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響39-47
• 3.1 材料39-40
• 3.1.1 儀器39
• 3.1.2 主要試劑與耗材39-40
• 3.2 方法40-42
• 3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代40
• 3.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖40
• 3.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)40-41
• 3.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)41
• 3.2.5 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)41-42
• 3.2.6 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)42
• 3.3 結(jié)果與分析42-45
• 3.3.1 MTT實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞的增殖42-43
• 3.3.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞的增殖43
• 3.3.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞遷移能力43-44
• 3.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞遷移能力44-45
• 3.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞侵襲能力45
• 3.4 小結(jié)45-46
• 3.5 討論46-47
• 總結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-57
• 攻讀碩士學(xué)位期間出版或發(fā)表的論著、論文57-58
• 致謝58

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 賀蘭湘,張先林;家族性乳腺癌遺傳易感基因研究現(xiàn)狀[J];國外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊;2000年05期

2 裴曉華,馬秀t，

本文編號：775311