發(fā)布時(shí)間：2017-09-01 21:29

  本文關(guān)鍵詞：Procaspase-8靶向腫瘤特異性藥物篩選穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建

  更多相關(guān)文章： Procaspase-8 細(xì)胞凋亡 CRISPR/Cas9 TRAIL

【摘要】：腫瘤的發(fā)生是一種復(fù)雜無(wú)序的過程,其發(fā)生機(jī)理和原因多種多樣,有先天遺傳因素,也有后天外界因素。正是由于它的復(fù)雜多變,致使癌癥仍然至今仍是世界醫(yī)學(xué)界的一個(gè)難題。隨著人類醫(yī)學(xué)水平的不斷進(jìn)步,越來(lái)越多的方法手段被應(yīng)用到了癌癥的治療中。癌癥傳統(tǒng)治療方式的缺點(diǎn)與不足,使生物靶點(diǎn)治療成為了新一代研究的熱點(diǎn)。TRAIL(Tumor necrosis factot-related apoptosis-inducing ligand,腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體)是TNF-α相關(guān)的細(xì)胞因子家族成員,由于其對(duì)正常細(xì)胞無(wú)傷害和對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性誘導(dǎo)凋亡,使TRAIL成為腫瘤治療的潛力藥物。然而TRAIL的生產(chǎn)成本及其保存運(yùn)輸所需的花費(fèi)開銷十分巨大,因此開發(fā)TRAIL類似活性的小分子化合物是非常必要的。天然產(chǎn)物是一個(gè)很大的化合物庫(kù),但是如何從海量的天然產(chǎn)物中找到TRAIL的功能類似物仍是一個(gè)難題。由美國(guó)Canon創(chuàng)立的一種分子熒光標(biāo)記技術(shù)配體-受體-募集物復(fù)合體熒光成像REFI給這一難題帶來(lái)福音,用綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記β-Arresting檢測(cè)G蛋白偶聯(lián)受體的活化。同樣我們可以利用該技術(shù)根據(jù)配體-受體-募集物復(fù)合體熒光成像技術(shù)的成功思路,來(lái)標(biāo)記細(xì)胞中TRAIL引發(fā)凋亡通路中的蛋白Procaspase-8,若加入的天然提取物在細(xì)胞中能引起與加入TRAIL時(shí)相同的變化,則該提取物中可能存在與TRAIL有類似功能的替代物。因此,以該靶點(diǎn)構(gòu)建篩藥平臺(tái)的穩(wěn)定細(xì)胞系成為這一方法的關(guān)鍵所在。云南動(dòng)植物資源豐富,是天然的藥物資源庫(kù),該方法為TRAIL替代物的發(fā)現(xiàn)篩選提供了可靠的工具。為了避免Procaspase-8的過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,且同時(shí)能使用分子熒光標(biāo)記技術(shù)篩選藥物,將Procaspase-8后面的募集信號(hào)凋亡的蛋白區(qū)域去掉,只選擇與FADD結(jié)合的區(qū)域Procase-8DED 1(1-84)(Prc8DED 1)的前84個(gè)氨基酸組成的小肽,如此既避免了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡,同時(shí)也能通過GFP熒光觀測(cè)prc8DED 1的熒光募集變化。該細(xì)胞模型目前已初步構(gòu)建成功。本實(shí)驗(yàn)的任務(wù)是摸清加入陽(yáng)性藥物后細(xì)胞的反應(yīng)變化,及加入藥物的最佳時(shí)間和濃度；以及利用第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)一步敲除內(nèi)源性Procaspase-8,以達(dá)到排除內(nèi)源性Procaspase-8競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DR4.DR5,優(yōu)化已構(gòu)建的篩選細(xì)胞模型的目的。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果：1、利用分子生物學(xué)手段成功構(gòu)建出細(xì)胞系U20S-Prc8DED1-GFP,將細(xì)胞消化懸浮后種入96孔L板中,設(shè)置濃度梯度和時(shí)間梯度,確定已構(gòu)建細(xì)胞系U20S-Prc8DED1-GFP的正確性以及對(duì)藥物TRAIL的敏感程度條件。用藥物TRAIL處理后,通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞綠色熒光開始發(fā)生凝聚,約30 min后,綠色熒光恢復(fù)原來(lái)舒展?fàn)顟B(tài),說明該細(xì)胞系對(duì)藥物TRAIL有應(yīng)激性。2、為了進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞系U20S-Prc8DED1-GFP,避免內(nèi)源性Procaspase-8對(duì)細(xì)胞表面受體DR4/5的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,利用第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9將內(nèi)源性Procaspase-8敲除,針對(duì)目標(biāo)靶序列設(shè)計(jì)構(gòu)建Guide-RNA.Donor DNA,通過電轉(zhuǎn)共轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞U20S-PrcDED 1-GFP當(dāng)中,篩選出帶有紅光的單克隆細(xì)胞,并加藥檢測(cè)細(xì)胞；結(jié)論：已初步確認(rèn)細(xì)胞系U20S-PrcDED 1-GFP對(duì)藥物TRAIL有一定的應(yīng)激性,CRISPR/Cas9敲除技術(shù)質(zhì)粒已構(gòu)建完備,目前正在轉(zhuǎn)染檢測(cè)細(xì)胞的過程當(dāng)中。
【關(guān)鍵詞】：Procaspase-8 細(xì)胞凋亡 CRISPR/Cas9 TRAIL
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.5
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 縮略表12-16
• 第一章 緒論16-26
• 1.1 Procaspase-8與DISC信號(hào)通路16-18
• 1.2 以TRAIL為激動(dòng)劑的抗腫瘤靶向的藥物篩選18-19
• 1.3 受體效應(yīng)復(fù)合物熒光成像技術(shù)(REFI)19
• 1.4 U2OS-Prc8DED1-GFP的構(gòu)建機(jī)制19-20
• 1.5 新的基因編輯技術(shù)--CRISPR/Cas920-22
• 1.6 CRISPR/Cas9的應(yīng)用前景22
• 1.7 研究目的22-23
• 1.8 研究路線23-26
• 1.8.1 細(xì)胞系U2OS-Prc8DED1-GFP鑒定方法23
• 1.8.2 優(yōu)化篩選細(xì)胞系U20S-Prc8DED1-GFP23-26
• 第二章 U2OS-Prc8DED1-GFP細(xì)胞系的驗(yàn)證26-58
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑配制27-38
• 2.1.1 載體、菌種及細(xì)胞27-28
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和耗材28-30
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和藥品30-32
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑的準(zhǔn)備32-38
• 2.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果38-58
• 2.2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)38-42
• 2.2.2 高內(nèi)涵顯微鏡下拍攝觀察42-45
• 2.2.3 圖片結(jié)果分析45-48
• 2.2.4 查找影響因素,優(yōu)化細(xì)胞系U2OS-Prc8DED1-GFP48-56
• 2.2.5 分析討論56-58
• 第三章 內(nèi)源性Procaspase-8的敲除58-92
• 3.1 實(shí)驗(yàn)思路及流程59-60
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料60
• 3.2.1 載體、菌種及細(xì)胞60
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器和耗材60
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑及藥品60
• 3.2.4 實(shí)驗(yàn)試劑配制60
• 3.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果分析60-92
• 3.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建60-86
• 3.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染86-90
• 3.3.3 單克隆細(xì)胞篩選90-91
• 3.3.4 藥物驗(yàn)證91-92
• 第四章 討論與總結(jié)92-94
• 參考文獻(xiàn)94-106
• 致謝106-107
• 附錄A 攻讀碩士期間發(fā)表論文目錄107

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 ;美國(guó)《科學(xué)》雜志2008年10大科學(xué)進(jìn)展揭曉[J];醫(yī)學(xué)信息學(xué)雜志;2009年01期

2 宋玉華;;一株人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系的建立及其性質(zhì)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊(cè);1981年01期

3 潘瓊婧;;人的惡性腫瘤連續(xù)性細(xì)胞系(株)的建系(株)標(biāo)準(zhǔn)的建議[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;1985年02期

4 李牧堯;馬梅蓀;;灰倉(cāng)鼠(Cricetulus migratorius)細(xì)胞系的建立及其部分生物學(xué)特性的觀察[J];新疆醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1987年04期

5 ;唐都醫(yī)院建立兩株細(xì)胞系克隆3條基因片段[J];中國(guó)腫瘤;1999年07期

6 陳永勤,易飛,李順意,秦昌華,梅興國(guó),俞翡;云南紅豆杉高紫杉醇含量細(xì)胞系的選擇[J];中國(guó)中藥雜志;2001年11期

7 錢麗娟;;人NK細(xì)胞系的建立及研究進(jìn)展[J];中國(guó)腫瘤;2009年12期

8 陳軍;細(xì)胞系在神經(jīng)生物學(xué)中的應(yīng)用[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;1991年02期

9 張慰慈,張建;人NK細(xì)胞系的建立及其在腫瘤生物治療中的應(yīng)用前景[J];中國(guó)腫瘤生物治療雜志;2002年03期

10 李冬娜,應(yīng)大君,區(qū)采瑩,符生苗,褚嘉,薛雅麗,黃小義;中國(guó)海南黎族永生B細(xì)胞系的建立與保存[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年15期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王官清;;水痘-帶狀皰疹病毒報(bào)告細(xì)胞系的構(gòu)建及應(yīng)用研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第16次全國(guó)皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集[C];2010年

2 張永忠;盛紅;李琳;安萍;陳佩蘭;鄭菁;;對(duì)兩株人細(xì)胞系的鑒定[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第五次會(huì)議論文摘要匯編[C];1992年

3 劉永霞;朱小麗;陳玉華;郭飛;沈默;陳占國(guó);徐威;陳德瑩;陶志華;;雄激素非依賴前列腺癌細(xì)胞系代謝組學(xué)的初步研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)醫(yī)院協(xié)會(huì)臨床檢驗(yàn)管理專業(yè)委員會(huì)第六屆全國(guó)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

4 張秀軍;;血源細(xì)胞系中P2Y受體的基因表達(dá)[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)2005年學(xué)術(shù)大會(huì)、青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2005年

5 張力;龔明玉;何瑞龍;張立廣;;X-射線對(duì)HepG2細(xì)胞系細(xì)胞周期進(jìn)程的影響[A];第五屆全國(guó)中醫(yī)藥免疫學(xué)術(shù)研討會(huì)——暨環(huán)境·免疫與腫瘤防治綜合交叉會(huì)議論文匯編[C];2009年

6 張鳳蘊(yùn);樊擁軍;陳君平;張飚;王麗群;;3種T細(xì)胞系細(xì)胞毒作用的比較[A];慶祝黑龍江省免疫學(xué)會(huì)成立十周年（1993—2003）論文集[C];2003年

7 王浩浩;滕理送;曹江;;新型靶向性藥物BP3323對(duì)SW480和SW620細(xì)胞系的作用研究[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2006年

8 張建華;張彩;許曉群;王郡甫;魏海明;;IL-12和IL-15對(duì)人NK92細(xì)胞系體外細(xì)胞毒效應(yīng)的影響[A];第九屆全國(guó)腫瘤生物治療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

9 張慧;范列英;盧天寶;宗明;;RNAi表達(dá)載體干擾四型肽精氨酸脫亞氨基酶基因在HL-60細(xì)胞系中的表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2008年

10 張曉;王傳新;李偉;張建;楊曉靜;鄭桂喜;;siRNA對(duì)HPV16 E7-HaCaT細(xì)胞系HLA-I類分子表達(dá)的作用研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2008年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 吳一福;我國(guó)建立首株HCC-7721/VCR細(xì)胞系[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

2 ;Ⅱ型膠原特異性T細(xì)胞系與關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的研究[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

3 張中橋;西京醫(yī)院建立穩(wěn)定表達(dá)MAGE-n細(xì)胞系[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

4 唐風(fēng);美建立前列腺癌新細(xì)胞系[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

5 記者 朱慶、蘇雁 通訊員 崔俊;白血病研究有重大突破[N];光明日?qǐng)?bào);2003年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 吳春萍;人高分化喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系FD-LSC-1的建立、鑒定及特征分析[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 程民;一種新的人NK細(xì)胞系的特性及其抗腫瘤效應(yīng)研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2010年

3 魯重美;人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（HepG2）所合成的2'5'低聚腺苷酸合成酶的生物學(xué)特點(diǎn)及其在臨床上的應(yīng)用[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1994年

4 郭華榮;海水魚細(xì)胞系FG、SPH和RSBF的特性分析及其在典型海洋污染物毒性檢測(cè)上的應(yīng)用[D];中國(guó)科學(xué)院海洋研究所;2001年

5 董向陽(yáng);人肺癌分子細(xì)胞遺傳學(xué)異常改變的研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1998年

6 仇惠英;伴有t（16；17）（q24；q12）不平衡染色體易位的人急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系SH-2的建立和鑒定[D];蘇州大學(xué);2007年

7 朱紅;HaCaT細(xì)胞系與皮膚鱗癌細(xì)胞系SCL-1蛋白質(zhì)組差異分析的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2006年

8 林雪梅;青蒿琥酯對(duì)K562細(xì)胞系CD34～+細(xì)胞的作用及分子機(jī)制[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2007年

9 楊洋;異常的表觀調(diào)控下調(diào)miR-663促進(jìn)原癌基因H-ras在K562細(xì)胞系的表達(dá)[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2011年

10 劉明利;兒童急性淋巴細(xì)胞白血病及細(xì)胞系p73、DCC、nm23-H1、nm23-H2和E2A-PBX1基因異常表達(dá)的研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2000年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 肖志文;胰腺癌高淋巴轉(zhuǎn)移細(xì)胞系建立及其腫瘤干細(xì)胞特性相關(guān)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 徐秋萍;穩(wěn)定表達(dá)乙型腦炎病毒NS2B/NS4B細(xì)胞系的構(gòu)建及其在篩選互作蛋白中的初步應(yīng)用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 楊艷津;硫酸銅和氯化鋅對(duì)不同倍性泥鰍鰭細(xì)胞系的毒性效應(yīng)[D];大連海洋大學(xué);2015年

4 魏春莉;TRIM28在腫瘤中的表達(dá)分析及其與腫瘤相關(guān)性機(jī)制研究[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

5 朱晨;siRNA沉默TUBB2C基因?qū)KM-1細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

6 錢雯瓊;SPINK6在不同細(xì)胞系中的表達(dá)和定位[D];復(fù)旦大學(xué);2012年

7 宋謹(jǐn);siRNA沉默SLC7A5基因?qū)KM-1細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

8 鄭婷婷;基于細(xì)胞系基因表達(dá)譜篩選耐藥基因標(biāo)志[D];電子科技大學(xué);2014年

9 吳香菊;穩(wěn)定高效表達(dá)豬CD163的MARC-145細(xì)胞系的構(gòu)建及其應(yīng)用[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

10 趙永祥;豬IRF1抗病毒功能的初步研究及穩(wěn)定表達(dá)IRF1基因PK-15細(xì)胞系的構(gòu)建[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：774415