本文關(guān)鍵詞：高保真DNA聚合酶分子開關(guān)在EGFR基因突變檢測中的應(yīng)用

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【摘要】：目的:針對五種可指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌臨床個(gè)體化用藥的相關(guān)EGFR突變基因,建立由高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)技術(shù)平臺(tái),并結(jié)合多重PCR,熒光定量PCR等診斷技術(shù),研發(fā)出一種快速,靈敏,廉價(jià)的EGFR基因診斷方法,以指肺癌的個(gè)體化治療。方法:相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,酪氨酸激酶抑制劑(TKI)(如吉非替尼,厄酪替尼)等肺癌治療藥物的療效在很大程度上由酪氨酸激酶的編碼區(qū)基因突變與否決定。其中,最為重要的突變包括第19外顯子15個(gè)堿基缺失,18個(gè)堿基缺失,L858R突變,S768I突變,以及獲得性突變T790M。本研究將含有EGFR突變的基因和野生基因,運(yùn)用PCR等技術(shù),亞克隆于質(zhì)粒載體中,經(jīng)轉(zhuǎn)化鋪板以及質(zhì)粒提取和擴(kuò)增等一系列的步驟來獲得含有EGFR載體,之后再根據(jù)構(gòu)建好的載體來制備突變和野生的EGFR模板。根據(jù)EGFR相關(guān)序列,針對S768I,T790M,L858R,15-bp和18-bp缺失5個(gè)突變位點(diǎn),設(shè)計(jì)相應(yīng)的分子開關(guān)引物(通過硫化磷酸化修飾,使之與突變模板完全吻合;而不完全與野生模板相吻合,具有針對突變的特異性)來構(gòu)成檢測EGFR突變的特異性體系。并且將該體系結(jié)合多重PCR,熒光定量PCR等相關(guān)技術(shù),檢測肺癌患者的腫瘤樣本,也可進(jìn)一步對血液中游離DNA進(jìn)行嘗試檢測。結(jié)果:本課題成功研發(fā)出針對五種EGFR突變基因的分子開關(guān)突變檢測系統(tǒng)。該突變檢測系統(tǒng)具有較高的靈敏性何特異性。對于與硫化修飾引物完全配對的突變模板其檢測的靈敏性達(dá)到10到100個(gè)拷貝,而對于與硫化修飾引物不完全配對的野生在模板濃度高于106個(gè)拷貝時(shí)候才出現(xiàn)擴(kuò)增,因此其特異性可達(dá)到106至107。當(dāng)熒光定量PCR以及多重PCR利用此體系來檢測,它們得到的結(jié)果與普通PCR較為一致。在僅有萬分之一突變模板濃度(突變模板:野生模板=1:10000)下,該體系仍能檢測到突變的存在。最為重要的是,運(yùn)用該體系檢測20例肺癌樣本,成功檢測出L858R突變患者兩例,經(jīng)測序驗(yàn)證結(jié)果正確,表明該檢測平臺(tái)完全可以應(yīng)用到臨床診斷。結(jié)論:高保真酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)技術(shù),對EGFR基因突變的檢測有較高的特異性和靈敏度,其高靈敏性的優(yōu)點(diǎn)對微量突變的檢測有重大的臨床意義,優(yōu)于傳統(tǒng)測序技術(shù),是指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥,產(chǎn)前診斷以及腫瘤早期發(fā)現(xiàn)的有力的分子診斷工具。
【關(guān)鍵詞】：高保真酶分子開關(guān) 基因診斷 肺癌 EGFR基因
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 引言9-11
• 研究材料11-13
• 研究方法13-26
• 研究結(jié)果26-35
• 討論35-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-42
• 綜述 非小細(xì)胞肺癌的靶向治療與EGFR基因突變的研究進(jìn)展42-55
• 參考文獻(xiàn)47-55
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文、科研成果55-56
• 附錄56-59
• 致謝59-60

【參考文獻(xiàn)】

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1 彭翠英,廖端芳,張佳,陳琳玲,李凱;單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法[J];中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2004年10期

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本文編號：773355