本文關(guān)鍵詞：Tf-PEG-PEI載RNA干擾質(zhì)粒靶向沉默PC-3細(xì)胞核干因子的體外實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 前列腺癌 核干因子 RNA干擾 基因治療 聚乙烯亞胺 非病毒載體 聚乙二醇

【摘要】：目的:合成多功能陽(yáng)離子聚合物Tf-PEG-PEI,建立一個(gè)生物相容性高、靶向、高效的RNAi傳遞系統(tǒng),使RNA干擾沉默前列腺癌PC-3細(xì)胞核干因子。方法:首先鑒定和提取核干因子的RNA干擾質(zhì)粒(NS-shRNA),同時(shí)合成載體Tf-PEG-PEI及鑒定其結(jié)構(gòu)的正確。將質(zhì)粒NS-shRNA分別與陽(yáng)離子聚合物PEI和Tf-PEG-PEI與形成復(fù)合物,研究?jī)煞N復(fù)合物在電解質(zhì)、血清及核酸酶存在的情況下,PEG化后的復(fù)合物結(jié)合比、粒徑及zeta電位大小,載體是否能保護(hù)DNA免受核酸酶的降解,以及載體Tf-PEG-PEI是否對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞具有靶向性。其后培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞系PC-3,通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)載體Tf-PEG-PEI對(duì)PC-3細(xì)胞的毒性,通過(guò)熒光倒置顯微鏡及流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染效率,同時(shí)以Tf-PEG-PEI為載體介導(dǎo)核干因子干擾質(zhì)粒NS-shRNA轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA及蛋白,RT-PCR及Western blot檢測(cè)核干因子(NS)基因沉默效果。結(jié)果:通過(guò)質(zhì)粒擴(kuò)增和測(cè)序鑒定,NS的RNA干擾序列成功插入載體GV248上,測(cè)序圖譜與預(yù)期一致。通過(guò)載體洗脫峰與蛋白凝膠電泳,證明成功合成了非病毒載體Tf-PEG-PEI。經(jīng)過(guò)PEG水化修飾后,Tf-PEG-PEI/NS-shRNA復(fù)合物在電解質(zhì)、蛋白質(zhì)的存在下,粒徑縮小,zeta電位為10mV,保持弱陽(yáng)性,有利于提高轉(zhuǎn)染效率。Tf-PEG-PEI/NS-shRNA復(fù)合物在N/P比為7.5時(shí)可以完全復(fù)合;當(dāng)Tf-PEG-PEI:NS-shRNA的N/P比為20時(shí),在熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率最大;MTT結(jié)果顯示,當(dāng)Tf-PEG-PEI的濃度應(yīng)為40μg/mL,NIH3T3細(xì)胞存活率在80%以上。通過(guò)Realtime-PCR和Westemblot檢測(cè),NS的mRNA和蛋白表達(dá)在經(jīng)過(guò)Tf-PEG-PEI/NS-shRNA轉(zhuǎn)染后,與未轉(zhuǎn)染組及空載體組比較,NS的mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:多功能載體Tf-PEG-PEI與NS-shRNA復(fù)合后,可以保護(hù)DNA免內(nèi)源性核酸酶的降解,PEG的水化層可避免聚合物之間聚集,減少了與血漿蛋白聚集,但PEG鏈段的接入還是會(huì)在一定程度上影響材料內(nèi)化入細(xì)胞后的逃逸和轉(zhuǎn)運(yùn)能力。通過(guò)前列腺癌PC-3細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的靶向效應(yīng)。多功能載體Tf-PEG-PEI可以介導(dǎo)NS-shRNA有效地沉默前列腺癌PC-3中NS基因的表達(dá),Tf-PEG-PEI是一種生物相容性好、靶向、高效的基因遞送系統(tǒng)。NS在臨床的治療上具有潛在的意義。在基因治療的方案中,使用的RNAi技術(shù)是一個(gè)有極大希望的治療策略。
【關(guān)鍵詞】：前列腺癌 核干因子 RNA干擾 基因治療 聚乙烯亞胺 非病毒載體 聚乙二醇
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-8
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明8-10
• 前言10-13
• 研究現(xiàn)狀、成果10-12
• 研究目的、方法12-13
• 實(shí)驗(yàn)對(duì)象和方法13-31
• 1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象13-19
• 2 實(shí)驗(yàn)方法19-31
• 結(jié)果31-42
• 討論42-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明51-52
• 綜述 前列腺癌的基因治療52-58
• 綜述參考文獻(xiàn)56-58
• 致謝58

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