本文關鍵詞：Tf-PEG-PEI載RNA干擾質粒靶向沉默PC-3細胞核干因子的體外實驗研究

  更多相關文章： 前列腺癌 核干因子 RNA干擾 基因治療 聚乙烯亞胺 非病毒載體 聚乙二醇

【摘要】：目的:合成多功能陽離子聚合物Tf-PEG-PEI,建立一個生物相容性高、靶向、高效的RNAi傳遞系統(tǒng),使RNA干擾沉默前列腺癌PC-3細胞核干因子。方法:首先鑒定和提取核干因子的RNA干擾質粒(NS-shRNA),同時合成載體Tf-PEG-PEI及鑒定其結構的正確。將質粒NS-shRNA分別與陽離子聚合物PEI和Tf-PEG-PEI與形成復合物,研究兩種復合物在電解質、血清及核酸酶存在的情況下,PEG化后的復合物結合比、粒徑及zeta電位大小,載體是否能保護DNA免受核酸酶的降解,以及載體Tf-PEG-PEI是否對前列腺癌PC-3細胞具有靶向性。其后培養(yǎng)前列腺癌細胞系PC-3,通過MTT實驗檢驗載體Tf-PEG-PEI對PC-3細胞的毒性,通過熒光倒置顯微鏡及流式細胞儀測定轉染效率,同時以Tf-PEG-PEI為載體介導核干因子干擾質粒NS-shRNA轉染PC-3細胞,提取細胞總RNA及蛋白,RT-PCR及Western blot檢測核干因子(NS)基因沉默效果。結果:通過質粒擴增和測序鑒定,NS的RNA干擾序列成功插入載體GV248上,測序圖譜與預期一致。通過載體洗脫峰與蛋白凝膠電泳,證明成功合成了非病毒載體Tf-PEG-PEI。經(jīng)過PEG水化修飾后,Tf-PEG-PEI/NS-shRNA復合物在電解質、蛋白質的存在下,粒徑縮小,zeta電位為10mV,保持弱陽性,有利于提高轉染效率。Tf-PEG-PEI/NS-shRNA復合物在N/P比為7.5時可以完全復合;當Tf-PEG-PEI:NS-shRNA的N/P比為20時,在熒光顯微鏡和流式細胞儀測定結果顯示轉染效率最大;MTT結果顯示,當Tf-PEG-PEI的濃度應為40μg/mL,NIH3T3細胞存活率在80%以上。通過Realtime-PCR和Westemblot檢測,NS的mRNA和蛋白表達在經(jīng)過Tf-PEG-PEI/NS-shRNA轉染后,與未轉染組及空載體組比較,NS的mRNA和蛋白表達明顯下調(diào),具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:多功能載體Tf-PEG-PEI與NS-shRNA復合后,可以保護DNA免內(nèi)源性核酸酶的降解,PEG的水化層可避免聚合物之間聚集,減少了與血漿蛋白聚集,但PEG鏈段的接入還是會在一定程度上影響材料內(nèi)化入細胞后的逃逸和轉運能力。通過前列腺癌PC-3細胞表面的轉鐵蛋白受體可以實現(xiàn)對腫瘤的靶向效應。多功能載體Tf-PEG-PEI可以介導NS-shRNA有效地沉默前列腺癌PC-3中NS基因的表達,Tf-PEG-PEI是一種生物相容性好、靶向、高效的基因遞送系統(tǒng)。NS在臨床的治療上具有潛在的意義。在基因治療的方案中,使用的RNAi技術是一個有極大希望的治療策略。
【關鍵詞】：前列腺癌 核干因子 RNA干擾 基因治療 聚乙烯亞胺 非病毒載體 聚乙二醇
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-8
• 縮略語/符號說明8-10
• 前言10-13
• 研究現(xiàn)狀、成果10-12
• 研究目的、方法12-13
• 實驗對象和方法13-31
• 1 實驗對象13-19
• 2 實驗方法19-31
• 結果31-42
• 討論42-46
• 結論46-47
• 參考文獻47-51
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明51-52
• 綜述 前列腺癌的基因治療52-58
• 綜述參考文獻56-58
• 致謝58

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 邱齡;肖傳實;曾秋棠;李茂蓮;;靶向血管緊張素Ⅱ受體基因的短發(fā)夾RNA的功能比較[J];第四軍醫(yī)大學學報;2006年23期

2 楊成明;張?zhí)m華;趙燕穎;吳雅臻;;整合素α_vβ_3小干擾RNA載體構建及其對人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的干擾效應檢測[J];中國老年學雜志;2008年07期

3 嚴小虎;常山;田家亮;;RNA干擾治療新進展[J];西南軍醫(yī);2008年04期

4 王志勇;呂延成;;RNA干擾中小干擾RNA的設計原則[J];醫(yī)學綜述;2010年05期

5 徐寧,陳智;哺乳動物RNA干擾中的小干擾RNA表達載體[J];國外醫(yī)學.流行病學傳染病學分冊;2004年04期

6 于國龍,何蘊韶;遺傳學研究的新工具:RNA干擾[J];國外醫(yī)學.遺傳學分冊;2005年04期

7 戚中田;嚴重急性呼吸綜合征相關冠狀病毒基因組研究的新技術——RNA干擾[J];第二軍醫(yī)大學學報;2003年06期

8 周昌華;章崇杰;;化學修飾小干擾RNA研究進展[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2006年08期

9 羅潔;夏曉波;熊思奇;宋偉濤;;RNA干擾對低分化鼻咽癌細胞血管內(nèi)皮生長因子表達的抑制作用[J];眼視光學雜志;2006年05期

10 何軍華;肖傳實;李茂蓮;邊云飛;;血管緊張素轉換酶短發(fā)夾RNA對自發(fā)性高血壓大鼠的降壓效果[J];中華高血壓雜志;2008年08期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 郭德銀;;RNA干擾在病毒研究和控制中的應用[A];第二屆中國青年學者微生物遺傳學學術研討會論文集[C];2006年

2 丁浩;李菊香;孫國芳;洪葵;程曉曙;;RNA干擾沉默細胞信號轉導抑制因子-1的表達對人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的影響[A];第十三次全國心血管病學術會議論文集[C];2011年

3 牛鵬霞;沈鶴;趙書紅;樊斌;;一種RNA干擾載體的構建及驗證[A];第十二次全國畜禽遺傳標記研討會論文集[C];2010年

4 張玉稚;王漢森;潘虹;李美蓉;包新華;金靖;吳希如;;大鼠Mecp_2基因的RNA干擾有效序列篩選[A];中華醫(yī)學會第十四次全國兒科學術會議論文匯編[C];2006年

5 孔祥平;;RNA干擾與乙型肝炎[A];2004年慢性乙型肝炎免疫治療進展學習班論文集[C];2004年

6 姜林娣;王吉耀;王漢洲;趙鳳娣;鮑春德;鄒和建;;RNA干擾抑制COX-2合成以及對類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞生物學活性的影響研究[A];第十二屆全國風濕病學學術會議論文集[C];2007年

7 譚兵;李瑜元;聶玉強;杜艷蕾;;RNA干擾對活化的小鼠巨噬細胞TNFα表達的影響[A];中華醫(yī)學會第七次全國消化病學術會議論文匯編（下冊）[C];2007年

8 朱t 燕;仇灝;周迎會;吳士良;;一種新型糖基轉移酶：β3GalT7基因的RNA干擾表達載體構建及其細胞學表型功能的初步研究[A];2008年全國糖生物學學術會議論文摘要[C];2008年

9 詹鷹;劉繼紅;封江南;肖恒軍;李忠遠;張朝暉;王濤;陳俊;王少剛;葉章群;;腺病毒介導的RNA干擾對人陰莖海綿體平滑肌細胞PDE5基因表達的抑制作用[A];第十六屆全國泌尿外科學術會議論文集[C];2009年

10 陳敏;何丹;馮九庚;唐容;洪濤;蔣麗萍;;RNA干擾沉默Cx43基因表達抑制血管再狹窄[A];中國藥理學會第十一次全國學術會議�？痆C];2011年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張中橋;第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院實現(xiàn)腫瘤特異性RNA干擾[N];中國醫(yī)藥報;2006年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 何國棟;RNAi抑制HIF-1α表達對腫瘤糖代謝影響的實驗研究[D];復旦大學;2012年

2 趙平;RNA干擾抑制結締組織生長因子對瘢痕疙瘩成纖維細胞功能影響的研究[D];第三軍醫(yī)大學;2008年

3 黃捷;RNA干擾熱休克蛋白27基因對自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細胞增殖、遷移的影響[D];福建醫(yī)科大學;2009年

4 陳家文;RNA三級結構折疊以及RNA干擾相關的動力學[D];武漢大學;2013年

5 陳波斌;核酶和RNA干擾靶向治療慢性粒細胞性白血病的實驗研究[D];復旦大學;2003年

6 蔡從利;以質粒為基礎的RNA干擾方法的建立以及凋亡相關基因HSD11的功能研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2005年

7 梁之聘;多靶位RNA干擾對HIV-1抑制作用的研究[D];南開大學;2014年

8 魏軍民;RNA干擾逆轉腫瘤多藥耐藥的實驗研究[D];山東大學;2005年

9 孫聰;STAT3特異性短干涉RNA抑制神經(jīng)膠質瘤細胞增殖的研究[D];吉林大學;2009年

10 閔安杰;RNA干擾沉默TREM-1對脆弱類桿菌脂多糖炎癥反應的抑制作用及其機制研究[D];中南大學;2007年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 曹布道;dsRNA和重組TMV介導的針對玉米黏蟲Chitinase基因的RNA干擾研究[D];內(nèi)蒙古大學;2015年

2 馮尚祥;人胰島素樣生長因子-1和RNA干擾多聚蛋白聚糖酶-1基因對人骨髓干細胞骨架的影響研究[D];青島大學;2015年

3 王超;Tf-PEG-PEI載RNA干擾質粒靶向沉默PC-3細胞核干因子的體外實驗研究[D];天津醫(yī)科大學;2015年

4 蔣曉芳;抗粗縮病RNA干擾表達載體的構建和玉米莖尖生長點原位轉化[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2010年

5 李志艷;應用小RNA及RNA干擾研究慢性髓性白血病的致病機理[D];西北農(nóng)林科技大學;2007年

6 戴兆基;RNA干擾介導的抗南方水稻黑條矮縮病毒研究[D];福建農(nóng)林大學;2012年

7 潘彥鵬;慢病毒介導RNA干擾對慢性粒細胞白血病增殖的影響[D];海南大學;2014年

8 劉敏;小干擾RNA對丙型肝炎病毒核心蛋白基因表達的抑制作用[D];第二軍醫(yī)大學;2006年

9 李兵;RNA干擾抑制草魚呼腸孤病毒復制的細胞模型[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2009年

10 楊濤;馬鈴薯淀粉合成酶Ⅲ基因cDNA的克隆及RNA干擾載體的構建[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學;2009年

，

本文編號：772330