本文關(guān)鍵詞：核不均一核糖核蛋白L在人腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

  更多相關(guān)文章： 腎透明細(xì)胞癌 hnRNPL 免疫組織化學(xué) Western blot LncRNA

【摘要】：背景與目的：腎細(xì)胞癌是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,是泌尿系統(tǒng)中惡性度較高的腫瘤,也是最常見(jiàn)的腫瘤之一,占腎臟原發(fā)性腫瘤的85%-90%,其中80%-90%為透明細(xì)胞癌(Clear Cell Renal Cell Carcinoma),并且其發(fā)病率近年來(lái)呈上升趨勢(shì)。由于腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,其早期臨床表現(xiàn)常不典型,故有近一半的患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于腎癌晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而喪失手術(shù)機(jī)會(huì)。同時(shí)腎癌對(duì)放療和化療均不敏感；而免疫治療的療效有限,故其最主要治療方法是手術(shù)切除術(shù),但術(shù)后復(fù)發(fā)率達(dá)25%-50%。總的來(lái)說(shuō),藥物和手術(shù)對(duì)于腎細(xì)胞癌患者無(wú)進(jìn)展生存期和總生存率依然不盡人意。缺乏特異性分子標(biāo)記物和有效地治療靶點(diǎn)是目前腎癌診治過(guò)程中所面臨的難題和關(guān)鍵。因此,腎透明細(xì)胞癌臨床診斷方式的突破及治療方法的改善有賴于基礎(chǔ)研究的重大進(jìn)展,有賴于對(duì)腎透明細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制的闡明。越來(lái)越多的證據(jù)表明,RNA的選擇性剪接作為一個(gè)廣泛存在的生物進(jìn)程,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其中,核不均一核糖核蛋白家族(hnRNPs)因具有選擇性剪接作用而在腫瘤發(fā)生中占據(jù)重要位置。核不均一核糖核蛋白L(hnRNP L)作為hnRNPs家族中的一員,近幾年在腫瘤中的研究相繼開(kāi)展,但是有關(guān)hnRNP L在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及其功能調(diào)控機(jī)制研究在國(guó)內(nèi)外尚無(wú)公開(kāi)報(bào)道。核內(nèi)不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)是存在于細(xì)胞核中的一類RNA結(jié)合蛋白,到目前為止已發(fā)現(xiàn)大約20多種hnRNPs(A-U)蛋白,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種hnRNPs蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。核不均一蛋白L (hnRNP L)是由Pinol-RomaS[21]等在早期轉(zhuǎn)錄片段中發(fā)現(xiàn)的富含胱氨酸及脯氨酸的核糖核蛋白,是核不均一核糖核蛋白(核蛋白)復(fù)合體的一個(gè)重要組成部分。HnRNP L作為RNA結(jié)合蛋白,參與染色體重塑、轉(zhuǎn)錄、翻譯的調(diào)控以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越引起重視。已有的生物信息學(xué)分析也顯示hnRNP L與hnRNPs家族數(shù)個(gè)成員是功能伴侶(function partner). Pubgene分析提示hnRNPL與細(xì)胞的凋亡、死亡和生長(zhǎng)等生物學(xué)進(jìn)程密切相關(guān)。近年來(lái)相繼有hnRNP L在腫瘤中的研究報(bào)道,證實(shí)hnRNP L可能通過(guò)影響mRNA前體剪接參與肝癌、肺癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和食管鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤發(fā)生,但其分子機(jī)制及可能涉及的信號(hào)通路尚未完全清楚。從已發(fā)表的文獻(xiàn)中未見(jiàn)hnRNP L在腎透明細(xì)胞癌中的作用機(jī)制研究,但是hnRNP L在其他相關(guān)領(lǐng)域中的機(jī)制研究已有報(bào)道。它可能通過(guò)以下機(jī)制起作用：1.mRNA前體剪接作用：hnRNP L通過(guò)與caspase-9前體mRNA結(jié)合調(diào)控肺癌細(xì)胞的侵襲力；同時(shí)hnRNP L也參與CEACAM1癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1)前體mRNA的選擇性剪接；2.受IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列)調(diào)節(jié)：IRES為非編碼RNA,折疊成類似于起始tRNA的結(jié)構(gòu),從而介導(dǎo)核糖體與RNA結(jié)合,起始蛋白質(zhì)翻譯。有文獻(xiàn)報(bào)道,hnRNP L發(fā)揮作用依賴于HCV-IRES活性;3.逆轉(zhuǎn)錄調(diào)控：hnRNP L可以作為主要影響因素通過(guò)結(jié)合LINE-1(長(zhǎng)分散元件)RNA參與逆轉(zhuǎn)錄調(diào)控；4.與miRNA相互作用：Jafarifar等發(fā)現(xiàn)有4種短鏈非編碼RNA(miRNA)結(jié)合在VEGFA(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)3’-非編碼區(qū)的順式作用元件上,而hnRNP L同樣結(jié)合于此區(qū)域,并且可以抑制miRNA的沉默作用。近期有研究表明：lncRNA-THRIL和hnRNP L形成的功能復(fù)合體可以與TNF α啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,通過(guò)調(diào)節(jié)Toll受體信號(hào)通路中的髓樣分化因子MyD88,達(dá)到調(diào)控TNFα基因轉(zhuǎn)錄的作用。該研究提示lncRNA及其結(jié)合蛋白在人類先天性免疫缺陷以及感染的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt、不編碼蛋白的RNA。IncRNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”,不具有生物學(xué)功能。然而,近年來(lái)的研究表明lncRNA能在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá),參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過(guò)程,與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展和防治都有著密切聯(lián)系。雖然近年來(lái)關(guān)于IncRNA的研究進(jìn)展迅猛,但是絕大部分的IncRNA的功能仍然是不清楚的。隨著研究的推進(jìn),各類IncRNA的大量發(fā)現(xiàn),IncRNA的研究已經(jīng)成為RNA研究的新領(lǐng)域。HnRNP L與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系已明確,然而到目前為止,其在腎透明細(xì)胞癌中的發(fā)生發(fā)展中的功能及其分子調(diào)控機(jī)制仍存在許多待闡明的重要問(wèn)題。HnRNP L參與的信號(hào)通路至今尚不清楚；闡明hnRNP L基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制是明確其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的重要基礎(chǔ)。本研究的開(kāi)展有助于發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞癌致病機(jī)理；為臨床腎透明細(xì)胞癌的早期診斷、治療及預(yù)后判斷提供新的分子標(biāo)志物。研究方法：(1)每例腎透明細(xì)胞癌切取約3mm×5mm大小組織,取材后立即置入凍存管中,放入液氮中保存。根據(jù)病理診斷結(jié)果初步分為腎透明細(xì)胞癌組和正常腎臟組織組。免疫組化檢測(cè)兩組樣本中hnRNP L的表達(dá)強(qiáng)度。染色表達(dá)評(píng)分方法根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)判。應(yīng)用Western blot驗(yàn)證hnRNP L蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織和癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)。然后應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析hnRNP L表達(dá)與患者臨床參數(shù)(包括：年齡、性別、腫瘤體積、TNM分期、病理分期、組織學(xué)分級(jí)等)與之間的相關(guān)性。(2) HnRNP L蛋白在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系,Kaplan-Meier法分析hnRNP L表達(dá)同患者生存時(shí)間之間的關(guān)系。此外,我們對(duì)hnRNP L檢測(cè)的敏感度及特異度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,判定其是否可作為腎透明細(xì)胞癌診斷的分子標(biāo)記物。(3)課題組另外成員已開(kāi)始研究hnRNP L的功能,本人前期通過(guò)采用Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0芯片,比較了敲低hnRNP L的腎癌SN12-PM6細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞lncRNA及mRNA的基因表達(dá)譜差異,初步分析hnRNP L在腎透明細(xì)胞癌中的可能調(diào)控機(jī)制。結(jié)果：(1)HnRNP L蛋白在90例腎透明細(xì)胞癌組織和癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)有差異,在腫瘤中為低表達(dá),hnRNP L蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi),呈彌漫性分布。HnRNP L蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為71.1%(64/90)；在腎透明細(xì)胞癌組織中hnRNP L蛋白顯色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及顯色強(qiáng)度較癌旁非腫瘤組織明顯減少,在少數(shù)癌旁非腫瘤組織中呈陰性表達(dá),陽(yáng)性表達(dá)率為98.9%(89/90),兩者比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；(2)90例腎透明細(xì)胞癌患者組織中,hnRNP L蛋白的表達(dá)與T分期、組織分級(jí)、臨床分期及腫瘤大小密切相關(guān)；其中,T1a、T1b和T2-T3期hnRNP L蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為88.9%(32/36)、76.7%(23/30)和37.5%(9/24),組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。組織學(xué)分級(jí)為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ患者中,hnRNP L蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為80.9%(38/47)、53.6%(15/28)和73.3%(11/15),組間比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。臨床分期為1期和2期患者中,hnRNP L蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為83.1%(54/65)和40.0%(10/25),組間比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。腫瘤大小中(≤178,178),hnRNP L蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為82.0%(50/61)和48.3%(14/29),組間比較差異有顯著性(P0.05)。然而,hnRNP L蛋白表達(dá)與患者年齡無(wú)明顯相關(guān)性；(3) Kaplan-Meier法分析顯示hnRNP L低表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著低于其高表達(dá)患者,hnRNP L低表達(dá)患者總生存時(shí)間(37.75±4.904)較短,hnRNP L高表達(dá)患者總生存時(shí)間(68.483±3.286)較長(zhǎng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LogRank=30.18,P=0.000)(粗線代表hnRNP L低表達(dá)組；虛線代表hnRNP L高表達(dá)組)。InRNP L陽(yáng)性組患者5年生存率75.0%(95%CI,64.024%,85.976%),然而hnRNP L陰性患者的5年生存率僅有20.8%(95%CI,4.532%37.068%)；對(duì)腫瘤體積小于178cm3的患者生存時(shí)間數(shù)據(jù)分析顯示在小體積腎癌中hnRNP L的差異表達(dá)患者生存時(shí)間也會(huì)產(chǎn)生顯著差異(P0.001)；對(duì)組織學(xué)分級(jí)在Ⅰ期的患者生存時(shí)間數(shù)據(jù)分析顯示Ⅰ期的早期腎癌中hnRNP L的差異表達(dá)患者生存時(shí)間也會(huì)產(chǎn)生顯著差異(P0.001);組織學(xué)分級(jí)在Ⅱ-Ⅲ期的患者同樣有顯著差異(P=0.007)；臨床分期Ⅰ的患者差異也較為顯著(P0.001)；TNM分期中的pT分期為Ⅰ期的患者差異同樣顯著(P0.001)；多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析顯示：hnRNP L是影響腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.009)；(4)對(duì)差異lncRNA/mRNA進(jìn)行了交集分析,在全部33000個(gè)LncRNA和30200個(gè)基因探針中,篩選出了hnRNP L表達(dá)水平相關(guān)的差異LncRNA 4506個(gè)(上調(diào)2178個(gè),下調(diào)2328個(gè)),mRNA 3781個(gè)(上調(diào)2488,下調(diào)1293個(gè))。結(jié)論：(1)HnRNP L蛋白在人腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)水平顯著低于癌旁非腫瘤組織,且與腎透明細(xì)胞癌病理參數(shù)呈負(fù)相關(guān),其表達(dá)水平的下降提示患者更差的預(yù)后；(2)HnRNP L可能作為腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素：(3)HnRNP L與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生存在聯(lián)系,其可能作為腎透明細(xì)胞癌患者早期診斷和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物。(4)HnRNP L可能通過(guò)與lncRNA的相互作用參與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：腎透明細(xì)胞癌 hnRNPL 免疫組織化學(xué) Western blot LncRNA
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.11
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-21
• 第一章 HnRNP L蛋白在人腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)鑒定21-31
• 1. 材料與方法21-27
• 2. 結(jié)果27-29
• 3. 討論29-31
• 第二章 HnRNP L蛋白在人腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性分析31-39
• 1. 材料與方法31-32
• 2. 結(jié)果32-37
• 3. 討論37-39
• 第三章 腎癌中HnRNP L蛋白與lncRNA相互調(diào)控機(jī)制的初步研究39-60
• 1. 材料與方法39-53
• 2. 結(jié)果53-55
• 3. 討論55-60
• 參考文獻(xiàn)60-67
• 在讀期間發(fā)表的論文67-68
• 致謝68-69

【共引文獻(xiàn)】

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1 Thomas S Lisse;Kanagasabai Vadivel;S Paul Bajaj;Rui Zhou;Rene F Chun;Martin Hewison;John S Adams;;The heterodimeric structure of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 dictates 1,25-dihydroxyvitamin D-directed transcriptional events in osteoblasts[J];Bone Research;2014年02期

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本文編號(hào)：771766