本文關(guān)鍵詞：GAS2-Calpain2軸維持白血病細(xì)胞的生長

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【摘要】：目的:GAS2(生長抑制特異性蛋白2)調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡和Calpain(鈣蛋白激酶)活性。GAS2-Calpain2軸在腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中具有雙重作用,但關(guān)于GAS2-Calpain2軸在白血病細(xì)胞中的功能研究還非常有限,本研究旨在初步探討GAS2-Calpain2軸在白血病細(xì)胞生長中的功能及作用機(jī)制。方法:(1)利用實時定量PCR(Quantitative Real-time PCR,Q-RT-PCR)和Calpain活性檢測等方法檢測各類白血病患者骨髓細(xì)胞及白血病細(xì)胞株中GAS2的m RNA表達(dá)及Calpain的活性;(2)Western blot和免疫熒光(Immunofluorescence,IF)技術(shù)檢測正常骨髓細(xì)胞、白血病患者骨髓細(xì)胞以及白血病細(xì)胞系中GAS2蛋白的表達(dá);(3)利用磷酸鈣沉淀法制備慢病毒,轉(zhuǎn)導(dǎo)THP-1和Jurkat細(xì)胞,Q-RT-PCR和Western blot等方法檢測干擾效率,比較GAS2沉默和對照細(xì)胞的增殖、集落生成和Calpain活性的差異;(4)注射對照和GAS2沉默THP1至裸鼠皮下,比較它們生成腫瘤的能力;(5)免疫共沉淀技術(shù)檢測GAS2與Calpain2在THP-1和Jurkat細(xì)胞中的相互作用,并研究Calpain2敲減在GAS2沉默誘導(dǎo)的生長抑制中的作用;(6)比較GAS2沉默和對照慢性髓細(xì)胞白血病(CML)患者CD34+細(xì)胞集落生成能力的差異。結(jié)果:(1)119例不同類型白血病患者骨髓中GAS2較正常骨髓都顯著異常高表達(dá);類似地,不同白血病細(xì)胞株中GAS2表達(dá)均較對照細(xì)胞顯著增高;Calpain活性在22例急性髓細(xì)胞白血病(AML)患者樣本中較正常骨髓顯著降低;(2)免疫熒光染色顯示白血病細(xì)胞株CCRF-CEM、SHI-1、Jurkat、THP-1和K562中GAS2蛋白表達(dá)均明顯高于正常骨髓細(xì)胞;(3)使用慢病毒遞送含sh NC(包含一段無義的對照sh RNA核苷酸序列)和sh919sh1206(分別以sh GAS2#1和sh GAS2#2表示,分別包含特異性沉默GAS2的sh RNA核苷酸序列)至THP-1和Jurkat細(xì)胞,GAS2的m RNA和蛋白表達(dá)抑制率均60%;沉默GAS2顯著增強(qiáng)THP-1和Jurkat細(xì)胞的Calpain的活性并抑制細(xì)胞增殖和集落生成能力;(4)GAS2沉默顯著抑制THP-1細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤能力;(5)通過免疫共沉淀證明了在Jurkat和THP-1細(xì)胞中GAS2特異性結(jié)合Calpain2而非Calpain1,在THP-1細(xì)胞中同時沉默GAS2和Calpain2能夠逆轉(zhuǎn)單獨沉默GAS2誘發(fā)的生長抑制;(6)在CML干/祖細(xì)胞中沉默GAS2顯著抑制它們的集落生成能力。結(jié)論:GAS2在多種人類白血病包括慢性髓細(xì)胞白血病(CML)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、急性髓細(xì)胞白血病(AML)均異常高表達(dá)。沉默GAS2在體內(nèi)和體外均能顯著抑制THP-1和Jurkat的細(xì)胞增殖并增強(qiáng)Calpain活性,沉默GAS2也抑制CML患者CD34+細(xì)胞的集落生成能力。GAS2特異結(jié)合Calpain2而非Calpain1,Calpain2參與GAS2沉默誘發(fā)的生長抑制。綜上,我們證實GAS2-Calpain2維持白血病細(xì)胞的生長。
【關(guān)鍵詞】：GAS2 Calpain2 GASDN 免疫共沉淀
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.7
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-12
• 材料和方法12-25
• 一、材料12-14
• 1.1 標(biāo)本及細(xì)胞系12
• 1.2 主要試劑12-13
• 1.3 主要儀器13-14
• 二、方法14-25
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)14
• 2.2 細(xì)胞總RNA提取14
• 2.3 白血病患者樣本收集14-15
• 2.4 熒光定量PCR15-16
• 2.5 蛋白免疫印跡實驗（Western blot）16-17
• 2.6 流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometric Analysis）17-18
• 2.7 免疫熒光染色（Immunofluorescence Staining）18
• 2.8 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）18-19
• 2.9 GAS2 慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建19-22
• 2.10 制備慢病毒22-23
• 2.11 細(xì)胞增殖和集落生成實驗23
• 2.12 Calpain活性的檢測23
• 2.13 裸鼠的皮下成瘤23-24
• 2.14 以Ps為載體遞送mi RNA24
• 2.15 細(xì)胞凋亡檢測24
• 2.16 統(tǒng)計學(xué)分析24-25
• 結(jié)果25-36
• 1、GAS2 在白血病細(xì)胞系株中的表達(dá)25-26
• 2、GAS2 在多種白血病細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)26
• 3、GAS2 為沉默抑制THP-1 和Jurkat細(xì)胞的生長26-28
• 4、過表達(dá)GAS2 能恢復(fù)由GAS2 沉默造成的生長抑制28-29
• 5、沉默 GAS2 造成的 THP-1 細(xì)胞增殖抑制與細(xì)胞凋亡相關(guān)29
• 6、沉默GAS2 顯著抑制THP-1 細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤能力29-30
• 7、沉默GAS2 抑制CML患者CD34+細(xì)胞的集落生成30-31
• 8、GAS2 與Calpain2 存在內(nèi)源性相互結(jié)合31-32
• 9、Calpain2 是沉默GAS2 抑制細(xì)胞生長所必需的32-34
• 10、GAS2 在不同白血病患者及正常骨髓標(biāo)本中的表達(dá)34-36
• 討論36-38
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 綜述 Calpain與腫瘤細(xì)胞41-53
• 參考文獻(xiàn)46-53
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文53-54
• 主要試劑配制54-55
• 中英文縮略詞匯表55-56
• 致謝56-58

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