本文關(guān)鍵詞：高遷移率族蛋白B1與晚期糖基化終產(chǎn)物受體對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

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【摘要】：背景前列腺癌是歐美國(guó)家男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤,在美國(guó)其死亡率僅次于肺癌居第二位。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì),美國(guó)2015年前列腺癌發(fā)病患者將達(dá)到220800人,占男性所有惡性腫瘤的26%,其死亡人數(shù)較前雖有輕微下降,但仍將達(dá)到27540人。我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率雖低于西方國(guó)家,但由于生活方式西化、人口老齡化及前列腺特異抗原(prostatic specific antigen, PSA)篩查的普及,近10年來前列腺癌的發(fā)病率和死亡率均呈明顯上升趨勢(shì),且增長(zhǎng)比歐美發(fā)達(dá)國(guó)家更為迅速。由于前列腺癌早期發(fā)病隱匿,患者確診時(shí)不少已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,因而失去了根治性治療的最佳時(shí)機(jī)。隨著直腸指診(DRE, Digital rectal examination)聯(lián)合PSA應(yīng)用篩查的普及,前列腺癌早期診斷率有了顯著的提高。但是PSA的敏感性和特異性皆存在一定的局限性,致使其在臨床應(yīng)用上仍存在一些爭(zhēng)議。當(dāng)以血清PSA10ng/ml為參考值時(shí),臨床漏診率為25%；當(dāng)PSA值位于臨床診斷灰區(qū)的4～10ng/ml時(shí),僅有30%的患者被診斷為前列腺癌。治療上,根治性治療(根治性前列腺切除術(shù)、外放射治療)是目前局限性前列腺癌最有效的治療方法,但部分根治性治療的早期前列腺癌患者仍有復(fù)發(fā)的可能。轉(zhuǎn)移性前列腺癌的治療目前主要依靠?jī)?nèi)分泌治療,但是往往因逐漸對(duì)激素非依賴而發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(Castrate-resistant Prostate Cancer,CRPC),使治療變得更加困難。由此,當(dāng)前需要迫切尋找新的特異性和敏感性均較高的前列腺癌標(biāo)志物以及潛在的治療新靶點(diǎn),盡可能做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)、早治療,并且進(jìn)一步提高療效,這是當(dāng)前前列腺癌研究的重要課題。但前列腺癌發(fā)生發(fā)和進(jìn)展的分子機(jī)制至今仍不清楚。以往的研究表明,前列腺癌的發(fā)生發(fā)展與染色體畸形、野生型p53、p16、PTEN、mn23、NKX3.1、Rb等抑癌基因的失活,c-myc、c-met、ras等癌基因的異常表達(dá),AR、PSA、 VDR等基因多態(tài)性及TMPRSS2-ERG基因融合等過程有關(guān)。而近年的研究表明,高遷移率族蛋白B1 (high mobility group protein B 1, HMGB 1)及其主要受體晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)也與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。HMGB1是高遷移率族蛋白B (high mobility group protein, HMGB)家族成員,因在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)的快速遷移而得名。HMGB1早期命名為兩性素(amphoterin),是一種存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白。細(xì)胞核內(nèi)的HMGB1參與穩(wěn)定核小體結(jié)構(gòu)、DNA重組和修復(fù)、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄及類固醇激素調(diào)控等生命活動(dòng)。胞內(nèi)HMGB1還可以由炎癥細(xì)胞主動(dòng)分泌或者壞死細(xì)胞被動(dòng)分泌進(jìn)入胞外。胞外的HMGB1同時(shí)是損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular pattern, DAMP)分子,參與許多腫瘤相關(guān)炎癥的發(fā)生。它能作為一種信號(hào)分子,由細(xì)胞核內(nèi)的分泌到細(xì)胞外,在免疫、炎癥、自噬、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移及腫瘤增殖轉(zhuǎn)移等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。胞外]HMGB1的受體包括RAGE、Toll樣受體家族(Toll-like receptor,TLR)、 CD24、IL-1R、髓系細(xì)胞觸發(fā)受體1(Triggering receptor expressed on myeloid cells 1,TREM-1)等。細(xì)胞外的HMGB1可以通過與其受體結(jié)合,主要是通過與RAGE結(jié)合,廣泛地參與了腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等過程。RAGE最早是Neeper等從牛肺中獲得的。它是一種單跨膜蛋白,屬于免疫球蛋白超家族跨膜受體。人RAGE編碼基因位于Ⅲ類主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex, MHC III)區(qū)域。人RAGE由404個(gè)氨基酸組成,位于細(xì)胞膜上,由胞外段、跨膜段和胞內(nèi)段組成。RAGE在人體生理情況下呈低水平表達(dá)(除成熟Ⅰ型肺泡細(xì)胞和胚胎細(xì)胞外),而在糖尿病、自身免疫病、神經(jīng)變性疾病、血管疾病及腫瘤等疾病中表達(dá)顯著增高。RAGE作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體介導(dǎo)其配體結(jié)合在單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞表面,激活細(xì)胞內(nèi)部各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,發(fā)生病理效應(yīng)。RAGE雖然是由于與晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGE)相互作用被發(fā)現(xiàn)并因此得名,但其配體除AGE之外,還包括HMGB1,p-淀粉樣多肽(amyloid-P peptide),S100蛋白等,這些配體分別與RAGE相互作用,激活相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng),在各種疾病中扮演著不同的角色。近些年來,HMGB1與RAGE對(duì)腫瘤的作用越來越受到人們的關(guān)注。目前已發(fā)現(xiàn)HMGB1/RAGE軸與包括結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、惡性間皮瘤等惡性腫瘤密切相關(guān)。研究認(rèn)為,HMGB1及其受體RAGE可調(diào)控這些腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,而阻斷RAGE與其配體HMGB1的相互作用,能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。HMGB1/RAGE軸與前列腺癌的作用關(guān)系是近年才被發(fā)現(xiàn)的。2003年,Kuniyasu等對(duì)40名術(shù)前經(jīng)促性腺激素釋放激素(luteinizing hormone-releasing hormone, LHRH)抑制劑去勢(shì)治療的pT3期前列腺癌患者的術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中的RAGE和HMGB1呈高表達(dá),在有轉(zhuǎn)移的患者中更明顯；進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在阻斷雄激素后,HMGB1/RAGE系統(tǒng)可通過旁分泌途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的相互作用,從而促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。2005年Ishiguro等研究發(fā)現(xiàn)HMGB1和RAGE在未經(jīng)治療的前列腺癌組織和激素難治性前列腺癌組織中的mRNA水平表達(dá)較正常前列腺組織明顯增高。在3種前列腺癌細(xì)胞株(DU145,PC-3和LNCaP細(xì)胞)中,發(fā)現(xiàn)在DU145即激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株中,RAGE表達(dá)最高。HMGB1在上述3個(gè)細(xì)胞株中均有表達(dá)。2012年Elangovan等通過體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過特異性阻斷HMGB1/RAGE軸能抑制前列腺腫瘤生長(zhǎng)。在我們前期的工作中,我們通過免疫組化證實(shí)在組織水平,HMGB1和RAGE在前列腺癌組織中存在高表達(dá),HMGB1和RAGE蛋白的表達(dá)以及兩者的共表達(dá)與前列腺癌的浸潤(rùn)深度、局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),進(jìn)一步對(duì)隨訪資料進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析后發(fā)現(xiàn),HMGB1和RAGE的共表達(dá)與晚期前列腺癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。但是,HMGB1和RAGE在前列腺癌中是否存在相互作用,及其相互作用對(duì)前列腺癌生物學(xué)行為(增殖、遷移、凋亡等)有何影響及可能存在的作用機(jī)制,我們將在細(xì)胞水平進(jìn)一步探索及驗(yàn)證。這將為HMGB1和RAGE對(duì)前列腺癌診斷、治療和評(píng)估的意義提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為前列腺癌的臨床診治提供新的思路和方法。方法基于以上認(rèn)識(shí),本研究首先進(jìn)行用Western Blot檢測(cè)3種前列腺癌細(xì)胞系及前列腺增生細(xì)胞系中HMGB1蛋白的表達(dá)情況；利用免疫熒光技術(shù)觀察HMGB1在前列腺癌細(xì)胞系和前列腺增生細(xì)胞系的定位情況；利用瓊脂糖親和柱(Ni-IDA)純化獲得外源性HMGB1蛋白；接著利用CCK-8檢測(cè)外源性HMGB1刺激下前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖情況；然后用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察外源性HMGB1刺激下前列腺癌PC-3細(xì)胞的遷移情況：再利用Annexin-V-FITC凋亡試劑盒檢測(cè)外源性HMGB1對(duì)PC-3凋亡能力的影響。利用免疫熒光觀察HMGB1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率,進(jìn)一步用Western Blot驗(yàn)證HMGB1過表達(dá)模型；接著分別利用CCK-8檢測(cè)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、凋亡試劑盒檢測(cè)過表達(dá)HMGB1下對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖、遷移情況、凋亡能力的影響。利用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)干擾前列腺癌PC-3細(xì)胞RAGE的表達(dá)；在沉默RAGE情況下,分別用CCK-8檢測(cè)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、凋亡試劑盒檢測(cè)外源性HMGB1對(duì)PC-3增殖、遷移和凋亡能力的影響,以觀察HMGB1與RAGE在前列腺癌細(xì)胞中的相互作用。結(jié)果1.前列腺癌細(xì)胞高表達(dá)HMGB1; HMGB1在前列腺增生細(xì)胞系和前列腺癌細(xì)胞系主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi),在細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá)。2.成功純化得到His-HMGB1融合蛋白。3.外源性 HMGB1呈濃度依賴性及時(shí)間依賴性促進(jìn)前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖；外源性HMGB1刺激前列腺癌細(xì)胞可促進(jìn)其遷移能力：外源性HMGB1刺激前列腺癌細(xì)胞可促進(jìn)其抗凋亡能力。4.觀察HMGB1質(zhì)粒在前列腺癌PC-3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,并成功構(gòu)建過表達(dá)HMGB1的前列腺癌細(xì)胞模型。5.過表達(dá)HMGB1蛋白可促進(jìn)前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖、遷移和抗凋亡能力。6.利用RNAi技術(shù)成功沉默前列腺癌PC-3細(xì)胞RAGE蛋白的表達(dá)。7.沉默RAGE后,HMGB1促進(jìn)前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖、遷移和抗凋亡的能力下降。結(jié)論本課題通過外源性刺激和細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)兩種方式,研究了HMGB1及其受體RAGE對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示HMGB1可通過RAGE促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及抗凋亡能力。這不但加深了我們對(duì)HMGB1與RAGE蛋白生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí),而且還為前列腺癌的診斷、治療和評(píng)估提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),為前列腺癌的臨床診治提供新的思路和方法。
【關(guān)鍵詞】：晚期糖基化終產(chǎn)物受體 高遷移率族蛋白B1 前列腺癌 生物學(xué)行為
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-23
• 材料23-29
• 1 主要儀器23-24
• 2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及耗材24-25
• 3 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株25
• 4 試劑配制25-29
• 方法29-39
• 1. 前列腺癌和前列腺增生細(xì)胞系中HMGB1的表達(dá)水平及定位29-31
• 2 HIs-HMGB1融合蛋白的純化和驗(yàn)證31
• 3 HMGB1刺激下對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞生物學(xué)功能的影響31-33
• 4 HMGB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞并過表達(dá)HMGB1蛋白33-34
• 5 HMGB1蛋白過表達(dá)對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞生物學(xué)功能的影響34-36
• 6 RNAI技術(shù)沉默PC-3細(xì)胞中RAGE蛋白的表達(dá)36
• 7 沉默RAGE蛋白時(shí),HMGB1刺激下PC-3細(xì)胞生物學(xué)功能的影響36-38
• 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理38-39
• 結(jié)果39-55
• 1 前列腺癌和前列腺增生細(xì)胞系中HMGB1的表達(dá)水平及定位39-41
• 2 HIs-HMGB1融合蛋白的純化和驗(yàn)證41-43
• 3 HMGB1刺激下對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞生物學(xué)功能的影響43-46
• 4 HMGB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞并過表達(dá)HMGB1蛋白46-47
• 5 HMGB1蛋白過表達(dá)對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞生物學(xué)功能的影響47-50
• 6 RNAI技術(shù)沉默PC-3細(xì)胞中RAGE蛋白的表達(dá)50-51
• 7 沉默RAGE蛋白時(shí),HMGB1刺激下PC-3細(xì)胞生物學(xué)功能的影響51-55
• 討論55-61
• 1 HMGB1蛋白與前列腺癌55-56
• 2 RAGE蛋白與前列腺癌56-57
• 3 HMGB1與RAGE蛋白相互作用在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的意義57-61
• 小結(jié)61-62
• 本研究的不足之處和下一步計(jì)劃62-63
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 發(fā)表文章67-68
• 英文縮略詞表68-70
• 致謝70-71

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：760798