本文關鍵詞：miR-21-3p在結直腸癌中作用的研究

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【摘要】：研究背景和目的結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,近年來在我國,隨著人們生活水平的提高,飲食習慣與結構的改變,結直腸癌發(fā)病率和死亡率均呈明顯上升的趨勢。其發(fā)病率隨年齡而增長,從40歲開始上升,60-75歲達到峰值,且具有年輕化,家族聚集,遺傳易感等特征。由于癌瘤生長速度緩慢,在其達到產生癥狀、體征之前要經過相當長的時間。因此結直腸癌發(fā)病隱匿,待患者出現癥狀入院治療時已出現轉移,這是影響療效和造成患者死亡的主要原因,也是結直腸癌術后復發(fā)的直接原因。目前對結直腸癌的治療以手術為主,輔以放化療,但療效欠佳。因此探索結直腸癌發(fā)生、發(fā)展機制并尋找相關的治療靶點具有重要的意義。MiR-21-3p是眾多microRNA的一種,它是pre-miR21在細胞漿中由Dicer加工后,生成的成熟micro RNA。和其配對的miR-21-5p豐度高,變化穩(wěn)定,在腫瘤中的功能和機制的研究已經日趨完善。所有的研究成果表明:miR-21-5p是在腫瘤中上調的micro RNA分子,且在不同組織腫瘤中的作用是一致的。那么miR-21-3p是否和癌基因mi R-21-5p在腫瘤中的作用相同?研究發(fā)現,miR-21-3p在三陰性乳腺癌、喉癌、腎臟、卵巢及子宮內膜癌等多種腫瘤中表達升高,由此可知,miR-21-3p在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著一定的調控作用,但機制并不明確。此外,miR-21-3p在結直腸癌中的作用沒有任何報道,有待進一步的探索和研究。研究方法1.miR-21-3p在結直腸癌組織及細胞中的表達懫用熒光定量RT-PCR的方法在33對結直腸癌標本組織及與其配對的癌旁組織中檢測miR-21-3p的表達,結合相應的病理組織信息,分析miR-21-3p的表達特點。檢測在本實驗室所有的11種結直腸癌細胞DLD-1、HCT-8、Caco-2、HCE-8693、RKO、SW480、SW620、HT29、LoVo、HCT116、LS174T中mi R-21-3p的表達,根據各個細胞中miR-21-3p的表達情況和細胞背景,選取合適的細胞進行實驗。2.mir-21-3p對結直腸癌細胞體內外生物學特性的影晌(1)訂購慢病毒對照空表達載體lv3和過表達載體lv3-mir-21-3p,用其感染選定的hct116、sw480細胞,在顯微鏡下觀察確定存在發(fā)綠色熒光的細胞后,用嘌呤霉素篩選含有慢病毒過表達載體的細胞株,持續(xù)兩周以上,通過rt-pcr鑒定mir-21-3p是否在選定的細胞株中過表達,之后利用cck8和劃痕實驗、transwell遷移、侵襲實驗,檢測mir-21-3p在體外對結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響;(2)將mircornamimicscontrol和mir-21-3pmimics分別瞬時轉染至上述實驗使用的兩株細胞中,利用westernblot和細胞熒光實驗,檢測mir-21-3p對emt(epithelial-mesenchymaltransition)指標的影響;(3)使用裸鼠作為整體可視化動物模型,對小鼠行皮下成瘤實驗,測量最終成瘤體積和重量,觀察mir-21-3p對裸鼠皮下成瘤能力的影響,同時利用得到的皮下瘤進行免疫組化實驗,檢測mir-21-3p對emt指標的影響;通過尾靜脈注射,構建小鼠肺轉移癌模型,通過觀察小鼠的肺部組織中轉移瘤的情況,進一步說明mir-21-3p對癌細胞轉移能力的影響。3.統(tǒng)計學分析采用spss17.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。組織和細胞的熒光定量pcr結果均比較2-△ct,不同之處在于組織采用配對樣本t檢驗,細胞懫用獨立樣本t檢驗(independent-samplesttest)。transwell遷移實驗、侵襲實驗,劃痕實驗檢測結果均采用獨立樣本t檢驗。p0.05為差異有統(tǒng)計學意義。研究結果1.mir-21-3p在結直腸癌組織及細胞中的表達熒光定量rt-pcr檢測結果顯示:在27對新鮮結直腸癌配對組織中,mir-21-3p在結直腸癌組織中的表達明顯高于正常粘膜組織,表達差異有統(tǒng)計學意義(t=-5.365,p=0.000)。mir-21-3p在rko細胞中的表達高于其他10種細胞。2.mir-21-3p對結直腸癌細胞體內外生物學特性的影響(1)用嘌呤霉素篩選構建的hct116和sw480過表達穩(wěn)定株,rt-pcr結果表明:和lv3-nc組相比,含有l(wèi)v3-mir-21-3p的hct116、sw480細胞中,miR-21-3p的表達水平上升,差異具有統(tǒng)計學意義(t=-15.019,p=0.000;t=-83.302,p=0.000)。(2)CCK8法對細胞體外增殖能力的改變進行檢測結果顯示:與LV3-NC組相比,LV3-miR-21-3p細胞增殖能力基本無變化,差異不具有統(tǒng)計學意義,說明miR-21-3p對于細胞的增殖能力沒有影響。(3)Transwell實驗和劃痕實驗表明:與LV3-NC組相比,穩(wěn)定過表達mi R-21-3p的HCT116、SW480細胞的遷移能力增強,同時差異具有統(tǒng)計學意義(t=-32.986,p=0.000;t=-11.620,p=0.000),該結果在遷移實驗和劃痕實驗中表現一致;小室侵襲實驗表明:與LV3-NC組相比,穩(wěn)定過表達miR-21-3p的HCT116、SW480細胞的侵襲能力增強,差異具有統(tǒng)計學意義(t=-9.257,p=0.000;t=-8.552,p=0.000)。(4)將mi R-21-3p mimics分別轉染結直腸癌細胞HCT116和SW480,RT-PCR結果表明:和mimics control組相比,轉染mimics后的HCT116、SW480細胞中,miR-21-3p的表達水平上升,差異具有統(tǒng)計學意義(t=-26.508,p=0.000;t=-60.562,p=0.000);在此基礎上,Western Blot和細胞熒光結果一致表明:轉染mimics后,結直腸癌細胞HCT116和SW480的EMT能力增強。(5)裸鼠皮下成瘤實驗表明:與LV3-NC組相比,穩(wěn)定過表達miR-21-3p的HCT116、SW480細胞所形成腫瘤的大小和重量相差無幾,并沒有統(tǒng)計學意義。皮下瘤免疫組化實驗顯示:穩(wěn)定過表達miR-21-3p后,結直腸癌細胞HCT116和SW480的EMT能力增強。裸鼠肺轉移癌說明:和LV3-NC相比,過表達miR-21-3p后,結直腸癌更易轉移,更易形成肺部腫瘤。結論1.MiR-21-3p在結直腸癌組織中的表達量遠遠高于癌旁組織;2.MiR-21-3p提升結直腸癌細胞侵襲和轉移能力,其靶基因的鑒定將在后續(xù)實驗中展開;
【關鍵詞】：microRNA 結直腸癌 遷移 侵襲
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 前言12-16
• 第一章 結直腸癌中miR213p的表達特性的鑒定16-24
• 一、材料與方法16-19
• 二、結果19-21
• 三、討論21-24
• 第二章 miR213p對結直腸癌細胞體內外生物學特性的影響24-47
• 第一節(jié) miR213p對結直腸癌細胞體外生物學特性的影響24-37
• 一、材料與方法24-29
• 二、結果29-37
• 第二節(jié) miR213p對結直腸癌細胞體內生物學特性的影響37-47
• 一、材料與方法37-40
• 二、結果40-44
• 三、討論44-47
• 第三章 miR213p靶基因的篩選與鑒定47-52
• 一、材料與方法47-49
• 二、結果49-51
• 三、討論51-52
• 綜述 MiR213p在常見腫瘤中的研究進展52-56
• 中英文縮略詞56-57
• 參考文獻57-60
• 致謝60-62

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