本文關(guān)鍵詞：CD151對人結(jié)腸癌腫瘤干細胞中Wnt相關(guān)靶基因影響的實驗研究

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【摘要】：CD151是四跨膜超家族蛋白(TM4SF)的癌基因,它可以促進細胞的運動、腫瘤的侵入和轉(zhuǎn)移。CD151基因通過促進腫瘤組織血管生長及血運重建而發(fā)揮其促進腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的作用。CD151敲除以后,導(dǎo)致了整個血管形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞。Wnt信號通路是腫瘤干細胞自我更新及致癌等功能中密切相關(guān)的重要信號通路。LRG1和LGR5都是Wnt信號通路的靶基因。LRG1蛋白能夠促進腫瘤血管的生長,其在正常血管生長中較少發(fā)揮作用。LGR5通過促進血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達,從而促進血管生長,最終促進腫瘤形成與轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞在無血清培養(yǎng)基(SFM)中培養(yǎng)可初步富集富含腫瘤干細胞的腫瘤細胞球。腫瘤干細胞理論認(rèn)為通過識別和利用腫瘤干細胞表面標(biāo)志可以準(zhǔn)確地篩選與分離腫瘤干細胞,CD133、CD44是目前被多數(shù)學(xué)者公認(rèn)的結(jié)腸癌腫瘤干細胞標(biāo)志物。目的:本研究通過Western blot方法對比研究結(jié)腸癌HT29細胞和敲除CD151基因(CD151-)的HT29細胞中Wnt通路相關(guān)靶基因LRG1和LGR5蛋白的表達與CD151的相關(guān)性,并通過流式細胞術(shù)高通量分選結(jié)腸癌干細胞技術(shù)篩選結(jié)腸癌HT29細胞和CD151-HT29細胞中高侵襲性CD44+CD133+HT29和CD151-CD44+CD133+HT29細胞亞群,檢測其成瘤組織中LRG1和LGR5蛋白的表達差異及與CD151的相關(guān)性,旨在探討CD151的表達對結(jié)腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移的作用。方法:1通過Western blot方法分別檢測CD151+HT29細胞及CD151-HT29細胞的CD15、LGR5、LRG1蛋白的表達情況,以探究結(jié)腸癌細胞中CD151基因與LGR5、LRG1的關(guān)系。2通過流式細胞儀分別篩選無血清培養(yǎng)基(SFM)組CD151+HT29細胞、CD151-HT29細胞和有血清培養(yǎng)基(SSM)組CD151+HT29細胞、CD151-HT29細胞中CD44+CD133+的表達,以篩選腫瘤干細胞相關(guān)亞群。3采用細胞增殖實驗、誘導(dǎo)分化實驗對流式分選得到的CD133+CD44+結(jié)腸癌干細胞進行鑒定。4采用流式分選后繼續(xù)培養(yǎng)的CD151+HT29細胞、CD151-HT29細胞、CD151+CD44+CD133+HT29細胞、CD151-CD44+CD133+HT29細胞分別種植于10只BALB/c-nu/nu裸鼠右側(cè)腋窩皮下進行裸鼠成瘤實驗,觀察2周后成瘤情況。5通過Western blot方法分別檢測CD151+HT29細胞、CD151-HT29細胞、CD151+CD44+CD133+HT29細胞、CD151-CD44+CD133+HT29細胞裸鼠成瘤組織中LGR5、LRG1蛋白的表達情況,以探究結(jié)腸癌種植瘤中CD151基因與LGR5、LRG1的關(guān)系。結(jié)果:1 Western blot結(jié)果顯示:(1)CD151蛋白在HT29細胞中表達,在敲除CD151細胞中沒有CD151蛋白的表達,提示該細胞株中不存在CD151基因的調(diào)控作用,(2)CD151-HT29細胞組和CD151+HT29細胞組相比,CD151-HT29細胞組LGR5和LRG1的蛋白表達下調(diào),有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),表明人結(jié)腸癌HT29細胞中CD151基因缺失明顯下調(diào)了LGR5和LRG1的蛋白表達。2流式細胞儀檢測結(jié)果顯示:CD151+HT29細胞SSM組和SFM組中CD44+CD133+細胞所占比例分別為:0.3%和1.4%,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);CD151-HT29細胞SSM組和SFM組中CD44+CD133+細胞所占比例分別為:2.7%和7.3%,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),表明無血清培養(yǎng)HT29細胞中CD44+CD133+所占的比例明顯高于有血清培養(yǎng)HT29細胞。3細胞增殖實驗結(jié)果顯示:7天內(nèi)CD151+HT29細胞隨著天數(shù)的增加細胞數(shù)增多即OD值升高;CD44+CD133+CD151+HT29細胞球組中的細胞在前兩天的生長較HT29組慢但是隨后成直線的升高;CD44+CD133+CD151-HT29細胞球組中的細胞生長在前四天內(nèi)較為緩慢在第五天后有所升高,CD151-HT29細胞組7天內(nèi)的生長緩慢,CD151-HT29細胞以及分選后取第二次傳代后CD151+CD44+CD133+HT29細胞球、CD151-CD44+CD133+HT29細胞球這三組細胞的以上生長趨勢與CD151+HT29細胞組相比具有顯著性差異(P0.01)。表明分選后CD44+CD133+CD151+HT29細胞比分選前HT29細胞的增殖能力明顯提高,敲除CD151基因后HT29細胞的增殖能力下降。誘導(dǎo)分化實驗表明:將無血清培養(yǎng)液中形成的結(jié)腸癌干細胞球置于含血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)可重新貼壁分化,細胞形態(tài)與之前培養(yǎng)的HT29細胞無明顯差異,形成貼壁生長的單層腫瘤細胞。4裸鼠成瘤實驗結(jié)果:2周后CD151+CD44+CD133+HT29細胞組、CD151-CD44+CD133+HT29細胞組、CD151+HT29細胞組和CD151-HT29細胞組裸鼠均成瘤,但CD151-CD44+CD133+HT29細胞組和CD151-HT29細胞組種植瘤均生長緩慢。裸鼠成瘤實驗表明篩選后結(jié)腸癌細胞具有干細胞特性,同時表明CD151影響了種植瘤體的生長。5 Western blot方法分別檢測CD151+HT29細胞、CD151-HT29細胞、CD151+CD44+CD133+HT29細胞、CD151-CD44+CD133+HT29細胞裸鼠成瘤組織中LGR5、LRG1蛋白的表達情況,結(jié)果顯示CD151+CD44+CD133+HT29細胞成瘤組織中LGR5、LRG1蛋白表達明顯高于其余3組,而CD151-HT29細胞組瘤組織中LGR5和LRG1的蛋白表達較其余3組明顯下調(diào),統(tǒng)計學(xué)比較有明顯差異(P0.05)。結(jié)論:1 CD151基因的缺失在HT29細胞中能明顯下調(diào)LRG1、LGR5的蛋白表達。2無血清培養(yǎng)HT29細胞有利于腫瘤干細胞表面標(biāo)志物CD44和CD133的富集;3通過流式細胞儀分選后HT29結(jié)腸癌干細胞的增殖能力明顯提高,此類細胞能夠促進結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。4高侵襲的結(jié)腸癌干細胞中LRG1、LGR5的蛋白表達明顯增強,提示CD151可能通過Wnt通路來介導(dǎo)增強結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。
【關(guān)鍵詞】：CD151 LRG1 LGR5 結(jié)腸癌 干細胞
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-26
• 結(jié)果26-28
• 附圖28-32
• 附表32-34
• 討論34-36
• 結(jié)論36
• 參考文獻36-39
• 綜述 腫瘤干細胞及其信號通路的研究現(xiàn)狀39-55
• 參考文獻48-55
• 致謝55-56
• 個人簡歷56

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