本文關鍵詞：CD151對人結腸癌腫瘤干細胞中Wnt相關靶基因影響的實驗研究

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【摘要】：CD151是四跨膜超家族蛋白(TM4SF)的癌基因,它可以促進細胞的運動、腫瘤的侵入和轉移。CD151基因通過促進腫瘤組織血管生長及血運重建而發(fā)揮其促進腫瘤侵襲及轉移的作用。CD151敲除以后,導致了整個血管形態(tài)結構的破壞。Wnt信號通路是腫瘤干細胞自我更新及致癌等功能中密切相關的重要信號通路。LRG1和LGR5都是Wnt信號通路的靶基因。LRG1蛋白能夠促進腫瘤血管的生長,其在正常血管生長中較少發(fā)揮作用。LGR5通過促進血管內皮生長因子(VEGF)的表達,從而促進血管生長,最終促進腫瘤形成與轉移。腫瘤細胞在無血清培養(yǎng)基(SFM)中培養(yǎng)可初步富集富含腫瘤干細胞的腫瘤細胞球。腫瘤干細胞理論認為通過識別和利用腫瘤干細胞表面標志可以準確地篩選與分離腫瘤干細胞,CD133、CD44是目前被多數(shù)學者公認的結腸癌腫瘤干細胞標志物。目的:本研究通過Western blot方法對比研究結腸癌HT29細胞和敲除CD151基因(CD151-)的HT29細胞中Wnt通路相關靶基因LRG1和LGR5蛋白的表達與CD151的相關性,并通過流式細胞術高通量分選結腸癌干細胞技術篩選結腸癌HT29細胞和CD151-HT29細胞中高侵襲性CD44+CD133+HT29和CD151-CD44+CD133+HT29細胞亞群,檢測其成瘤組織中LRG1和LGR5蛋白的表達差異及與CD151的相關性,旨在探討CD151的表達對結腸癌侵襲與轉移的作用。方法:1通過Western blot方法分別檢測CD151+HT29細胞及CD151-HT29細胞的CD15、LGR5、LRG1蛋白的表達情況,以探究結腸癌細胞中CD151基因與LGR5、LRG1的關系。2通過流式細胞儀分別篩選無血清培養(yǎng)基(SFM)組CD151+HT29細胞、CD151-HT29細胞和有血清培養(yǎng)基(SSM)組CD151+HT29細胞、CD151-HT29細胞中CD44+CD133+的表達,以篩選腫瘤干細胞相關亞群。3采用細胞增殖實驗、誘導分化實驗對流式分選得到的CD133+CD44+結腸癌干細胞進行鑒定。4采用流式分選后繼續(xù)培養(yǎng)的CD151+HT29細胞、CD151-HT29細胞、CD151+CD44+CD133+HT29細胞、CD151-CD44+CD133+HT29細胞分別種植于10只BALB/c-nu/nu裸鼠右側腋窩皮下進行裸鼠成瘤實驗,觀察2周后成瘤情況。5通過Western blot方法分別檢測CD151+HT29細胞、CD151-HT29細胞、CD151+CD44+CD133+HT29細胞、CD151-CD44+CD133+HT29細胞裸鼠成瘤組織中LGR5、LRG1蛋白的表達情況,以探究結腸癌種植瘤中CD151基因與LGR5、LRG1的關系。結果:1 Western blot結果顯示:(1)CD151蛋白在HT29細胞中表達,在敲除CD151細胞中沒有CD151蛋白的表達,提示該細胞株中不存在CD151基因的調控作用,(2)CD151-HT29細胞組和CD151+HT29細胞組相比,CD151-HT29細胞組LGR5和LRG1的蛋白表達下調,有統(tǒng)計學差異(P0.05),表明人結腸癌HT29細胞中CD151基因缺失明顯下調了LGR5和LRG1的蛋白表達。2流式細胞儀檢測結果顯示:CD151+HT29細胞SSM組和SFM組中CD44+CD133+細胞所占比例分別為:0.3%和1.4%,有統(tǒng)計學差異(P0.05);CD151-HT29細胞SSM組和SFM組中CD44+CD133+細胞所占比例分別為:2.7%和7.3%,有統(tǒng)計學差異(P0.05),表明無血清培養(yǎng)HT29細胞中CD44+CD133+所占的比例明顯高于有血清培養(yǎng)HT29細胞。3細胞增殖實驗結果顯示:7天內CD151+HT29細胞隨著天數(shù)的增加細胞數(shù)增多即OD值升高;CD44+CD133+CD151+HT29細胞球組中的細胞在前兩天的生長較HT29組慢但是隨后成直線的升高;CD44+CD133+CD151-HT29細胞球組中的細胞生長在前四天內較為緩慢在第五天后有所升高,CD151-HT29細胞組7天內的生長緩慢,CD151-HT29細胞以及分選后取第二次傳代后CD151+CD44+CD133+HT29細胞球、CD151-CD44+CD133+HT29細胞球這三組細胞的以上生長趨勢與CD151+HT29細胞組相比具有顯著性差異(P0.01)。表明分選后CD44+CD133+CD151+HT29細胞比分選前HT29細胞的增殖能力明顯提高,敲除CD151基因后HT29細胞的增殖能力下降。誘導分化實驗表明:將無血清培養(yǎng)液中形成的結腸癌干細胞球置于含血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)可重新貼壁分化,細胞形態(tài)與之前培養(yǎng)的HT29細胞無明顯差異,形成貼壁生長的單層腫瘤細胞。4裸鼠成瘤實驗結果:2周后CD151+CD44+CD133+HT29細胞組、CD151-CD44+CD133+HT29細胞組、CD151+HT29細胞組和CD151-HT29細胞組裸鼠均成瘤,但CD151-CD44+CD133+HT29細胞組和CD151-HT29細胞組種植瘤均生長緩慢。裸鼠成瘤實驗表明篩選后結腸癌細胞具有干細胞特性,同時表明CD151影響了種植瘤體的生長。5 Western blot方法分別檢測CD151+HT29細胞、CD151-HT29細胞、CD151+CD44+CD133+HT29細胞、CD151-CD44+CD133+HT29細胞裸鼠成瘤組織中LGR5、LRG1蛋白的表達情況,結果顯示CD151+CD44+CD133+HT29細胞成瘤組織中LGR5、LRG1蛋白表達明顯高于其余3組,而CD151-HT29細胞組瘤組織中LGR5和LRG1的蛋白表達較其余3組明顯下調,統(tǒng)計學比較有明顯差異(P0.05)。結論:1 CD151基因的缺失在HT29細胞中能明顯下調LRG1、LGR5的蛋白表達。2無血清培養(yǎng)HT29細胞有利于腫瘤干細胞表面標志物CD44和CD133的富集;3通過流式細胞儀分選后HT29結腸癌干細胞的增殖能力明顯提高,此類細胞能夠促進結腸癌的侵襲和轉移。4高侵襲的結腸癌干細胞中LRG1、LGR5的蛋白表達明顯增強,提示CD151可能通過Wnt通路來介導增強結腸癌的侵襲和轉移。
【關鍵詞】：CD151 LRG1 LGR5 結腸癌 干細胞
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-26
• 結果26-28
• 附圖28-32
• 附表32-34
• 討論34-36
• 結論36
• 參考文獻36-39
• 綜述 腫瘤干細胞及其信號通路的研究現(xiàn)狀39-55
• 參考文獻48-55
• 致謝55-56
• 個人簡歷56

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