本文關(guān)鍵詞：胱氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： xCT sut 細(xì)胞 乳腺癌細(xì)胞 自體吞噬 上皮細(xì)胞間質(zhì)化

【摘要】：研究目的:第一部分:胱氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(x CT)是氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的功能性亞基,細(xì)胞膜上x CT的表達(dá)與細(xì)胞攝取胱氨酸關(guān)系密切,而胱氨酸是細(xì)胞內(nèi)合成谷胱甘肽(GSH)所必不可少的,對維持細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平起著重要的作用。GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑,在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡中起重要作用。Sut突變小鼠,是經(jīng)典的Hermansky Pudlak綜合癥小鼠模型,在sut細(xì)胞中,由于編碼x CT蛋白的Slc7a11基因的突變,編碼的蛋白變?yōu)閤 CT-sut,其C-端的9個(gè)氨基酸替代了野生型x CT的C-端20個(gè)氨基酸。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)x CT缺陷能夠抑制sut細(xì)胞的生長,并通過JNK信號通路觸發(fā)細(xì)胞凋亡,但通過流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞只占死亡細(xì)胞的一部分,其他死亡細(xì)胞是通過何種途徑死亡的還不清楚。因此我們選取x CT缺陷的小鼠黑色素細(xì)胞sut作為研究對象,在前期工作的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討x CT缺陷誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制。第二部分:乳腺癌是全球女性最常見的癌癥之一,在過去20年中大多數(shù)國家的發(fā)病率持續(xù)增長。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性是乳腺癌高致死率的首要原因,癌細(xì)胞易發(fā)生轉(zhuǎn)移,手術(shù)治療的效果并不能令人滿意。因此了解癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制是降低癌癥患者死亡率的重要因素。近年來研究發(fā)現(xiàn)x CT在多種高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中表達(dá)升高,我們在前期研究中也發(fā)現(xiàn)x CT在乳腺癌、肝癌和黑色素瘤中高表達(dá)。但其與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚未報(bào)道,因此本研究旨在探討x CT在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中的作用及其機(jī)制。研究方法:第一部分:為確定sut細(xì)胞是否發(fā)生自噬,我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)方法檢測了自噬相關(guān)基因ATG5、ATG7、ATG12的表達(dá),采用Western blot方法檢測了自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-I、LC3-II以及Beclin1蛋白的表達(dá);為確定x CT缺陷是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)sut細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡,我們檢測了由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵分子ATF6以及IRE1-XBP1的表達(dá);然后用Western blot方法檢測了Akt/m TOR/p70S6K信號通路中關(guān)鍵蛋白質(zhì)磷酸化水平的改變,確定Akt/m TOR/p70S6K是否參與x CT缺陷誘導(dǎo)的自噬;最后,用p38 MAPK抑制劑SB203580處理sut細(xì)胞,以探討p38 MAPK信號通路對x CT誘導(dǎo)的自噬的影響。第二部分:我們對人類高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231轉(zhuǎn)染入SLC7A11-RNAi質(zhì)粒,敲降x CT,然后利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測x CT敲降后,MDA-MB-231遷移及侵襲能力的改變。利用Western Blot和RT-PCR方法檢測其自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)C3-I,LC3-II,EMT(上皮細(xì)胞間質(zhì)化)過程相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin以及轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)水平的改變。確定EMT是否參與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的轉(zhuǎn)移,以及x CT是否通過自噬途徑參與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的轉(zhuǎn)移。結(jié)果:第一部分:1.通過電子顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)x CT缺陷導(dǎo)致sut細(xì)胞中出現(xiàn)了脂滴和自噬體;在x CT缺陷的sut細(xì)胞中,自噬相關(guān)基因ATG5、ATG7、ATG12的表達(dá)升高,自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)C3-II/LC3-I的比值升高,Beclin1蛋白的表達(dá)上調(diào);自噬抑制劑3-MA處理sut細(xì)胞48h后觀察到細(xì)胞死亡數(shù)量減少。2.在x CT缺陷的sut細(xì)胞中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵分子ATF6的裂解胞質(zhì)片段(ATF6f)迅速產(chǎn)生,但沒有檢測到XBP1的裂解片段。3.在x CT缺陷的sut細(xì)胞中檢測到Akt在Thr308位點(diǎn)、m TOR在Thr2481位點(diǎn)、p70S6K在Thr389位點(diǎn)的磷酸化水平降低。4.苯基丁酸能夠促進(jìn)蛋白折疊以及抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,在x CT缺陷的sut細(xì)胞中加入苯基丁酸后,發(fā)現(xiàn)Akt在Thr308位點(diǎn)、m TOR在Thr2481位點(diǎn)、p70S6K在Thr389位點(diǎn)的磷酸化水平升高,苯基丁酸的加入抑制了LC3I向LC3II轉(zhuǎn)換。5.在x CT缺陷的sut細(xì)胞中,p38 MAPK,ERK磷酸化水平升高,核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)水平升高;加入p38 MAPK抑制劑SB203580顯著抑制了Beclin1的表達(dá)升高;加入苯基丁酸抑制了p38 MAPK磷酸化水平及ERK磷酸化水平。第二部分:1.人類低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞MCF-7中x CT的表達(dá)明顯低于人類高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231。2.敲降x CT后的MDA-MB-231細(xì)胞,與對照組相比,細(xì)胞劃痕的愈合速度明顯減慢,穿膜細(xì)胞明顯減少。3.敲降xCT后,上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)升高,間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)降低;敲降x CT前后,MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Snail的m RNA水平?jīng)]有明顯的變化,而Snail的蛋白水平降低。4.敲降xCT后,MDA-MB-231細(xì)胞中LC3-II/LC3-I的比值增高。結(jié)論:第一部分:xCT缺陷能夠誘導(dǎo)sut細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自體吞噬。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過激活p38 MAPK信號通路進(jìn)而抑制Akt/m TOR/p70S6K信號通路,從而介導(dǎo)了x CT缺陷誘導(dǎo)的自噬,最終導(dǎo)致sut細(xì)胞的自噬性死亡。第二部分:x CT在人類高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中高表達(dá)。敲降x CT的表達(dá)可以使人類高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231發(fā)生自噬,降解轉(zhuǎn)錄因子Snail,從而抑制EMT,降低人類高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的轉(zhuǎn)移能力。
【關(guān)鍵詞】：xCT sut 細(xì)胞 乳腺癌細(xì)胞 自體吞噬 上皮細(xì)胞間質(zhì)化
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 縮略語/符號說明13-15
• 一、xCT缺陷誘導(dǎo)sut細(xì)胞自噬性死亡的作用機(jī)制研究15-39
• 1.1 前言15-18
• 1.1.1 研究現(xiàn)狀、成果15-17
• 1.1.2 研究目的、方法17-18
• 1.2 對象和方法18-30
• 1.2.1 實(shí)驗(yàn)對象18
• 1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器及實(shí)驗(yàn)試劑18-22
• 1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法22-30
• 1.3 結(jié)果30-35
• 1.3.1 xCT缺陷誘導(dǎo)sut細(xì)胞發(fā)生自噬及自噬性死亡30
• 1.3.2 xCT缺陷誘導(dǎo)sut細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激30-32
• 1.3.3 sut細(xì)胞中Akt/m TOR/p70S6K信號通路參與誘導(dǎo)自噬32-33
• 1.3.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過Akt/m TOR/p70S6K信號通路調(diào)節(jié)自噬和自噬性細(xì)胞死亡33-34
• 1.3.5 sut細(xì)胞中p38 MAPK信號通路參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬34-35
• 1.4 討論35-38
• 1.5 小結(jié)38-39
• 二、xCT調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究39-53
• 2.1 前言39-40
• 2.1.1 研究現(xiàn)狀、成果39-40
• 2.1.2 研究目的、方法40
• 2.2 對象和方法40-44
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)對象40-41
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器及實(shí)驗(yàn)試劑41
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)方法41-44
• 2.3 結(jié)果44-50
• 2.3.1 xCT的表達(dá)可能與人類乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力相關(guān)44-45
• 2.3.2 敲降xCT可以降低人類高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移能力和侵襲能力45-46
• 2.3.3 Snail參與xCT對EMT的調(diào)控過程46-50
• 2.3.4 降低xCT的表達(dá)可使人類高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬進(jìn)而降解Snail50
• 2.4 討論50-52
• 2.5 小結(jié)52-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-60
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明60-61
• 綜述 自噬與腫瘤的關(guān)系61-72
• 綜述參考文獻(xiàn)68-72
• 致謝72

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