本文關(guān)鍵詞：miR-495調(diào)控TSPAN12在小細胞肺癌耐藥和增殖中的作用研究

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【摘要】：研究背景最新統(tǒng)計資料顯示,在全球范圍內(nèi),肺癌是首要的癌癥死亡原因,同時也是男性和女性第二個最常見的惡性腫瘤。目前,肺癌的發(fā)病率仍然呈持續(xù)上升的趨勢。國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布的((2013中國腫瘤登記年報》在對全國216個登記處的1.58億人進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析后也表示：肺癌已位居我國居民惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率首位,是我國發(fā)病率和死亡率增長速度最快,對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。肺癌按照細胞類型分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)兩類,其中SCLC約占全部原發(fā)性肺癌的20%。小細胞肺癌的發(fā)生可能與多種基因相關(guān),包括原癌基因如Bcl-2、myc、ras、c-erbB-2基因等,抑癌基因如p53、視神經(jīng)母細胞瘤基因(RB基因)、CDKN2及FHIT基因等；此外,有研究表明SCLC的發(fā)生還與信號通路PI3K/AKT/mTOR和抗凋亡基因caspase-8甲基化等因素相關(guān)。目前認為小細胞肺癌起源于支氣管粘膜或其腺上皮內(nèi)的Kulchitsky細胞(嗜銀細胞),該細胞呈類圓形或梭形,胞漿稀少,富含多巴脫羧酶(L-dopa decarboxylase)、蛙皮素(bombesin)及神經(jīng)元特異性烯醇化酶(enzyme neuron-specific enolase)等神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒,屬于APUD (amine precursor uptake decarboxylation)瘤。小細胞肺癌細胞分化程度低,惡性程度高,生長速度較快,倍增時間短,轉(zhuǎn)移發(fā)生早而廣泛(按照美國退伍軍人醫(yī)院肺癌研究小組制定的SCLC分期系統(tǒng),大約有三分之二的小細胞肺癌患者在確診時已經(jīng)處于廣泛期),臨床上多采用以化療為主的綜合手段進行治療。雖然癌細胞對化學治療和放射治療敏感,初次治療緩解率高,但SCLC極易發(fā)生獲得性耐藥而復發(fā),預后不良。目前小細胞肺癌的控制仍然不理想,尋找影響癌細胞增殖和藥物敏感性的關(guān)鍵分子,可讓我們對該腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制有更深入的了解,并期望為臨床醫(yī)學研究提供理論基礎�？缒に牡鞍�(tetraspanin)家族是一類進化保守的細胞膜蛋白,廣泛表達于不同物種中。在人類中,研究人員已發(fā)現(xiàn)33個該蛋白家族成員,它們均具有典型的4個高度疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain 1-4, TM1-4),兩側(cè)處于胞漿內(nèi)的N末端和C末端。目前關(guān)于跨膜四蛋白家族的研究仍處于起始階段,一般認為該蛋白分子可與多種整合素、生長因子及其受體、人類白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)分子和主要組織相容復合物(major histocompatibility complex, MHC)等內(nèi)源性細胞表面蛋白分子相連,形成富tetraspanin微區(qū)(tetraspanin enrich microdomains, TEMs),在連接細胞膜內(nèi)外信號上起到通信平臺作用,從而參與調(diào)控細胞增殖、遷移及粘附等多種生命活動。另外,在高等脊椎類動物中,跨膜四蛋白還被發(fā)現(xiàn)參與病原體的識別與進入和腫瘤細胞的分化、遷移及侵襲等過程。TSPAN12 (Transmembrane 4 superfamily member 12, also Tetraspan NET-2)作為人類跨膜四蛋白家族重要成員之一,是視網(wǎng)膜血管形成的關(guān)鍵調(diào)控因子,主要與家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變familial exudative vitreoretinopathy, FEVR)等疾病過程相關(guān)。同時,TSPAN12也是人類33個跨膜四蛋白中對腫瘤生物學活性起調(diào)節(jié)作用的分子之一。Wachi S等利用芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn),TSPAN12基因在肺癌、乳腺癌及前列腺癌等多種人類腫瘤中表達異[20-23]；Knoblich K等研究發(fā)現(xiàn)TSPAN12可通過β-catenin信號途徑促進乳腺癌細胞體內(nèi)增殖過程而抑制癌細胞轉(zhuǎn)移；Otomo R等研究人員發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞中P53基因突變所致的TSPAN12表達上調(diào)可促進基質(zhì)旁癌細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過程。TSPNA12可能對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著促癌因子的作用,然而該基因是否參與小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展尚未有報道。本課題組對小細胞肺癌耐藥細胞株和化療敏感細胞株進行基因芯片分析發(fā)現(xiàn),與敏感株對比,TSPAN12在耐藥株中表達較高,提示TSPAN12可能參與小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程,并與癌細胞耐藥的發(fā)生有關(guān)。本課題擬探討TSPAN12在小細胞肺癌增殖和耐藥中的作用,從而加深我們對SCLC化療抗藥性發(fā)生機制的認識,并期望為小細胞肺癌提供新的治療靶點。MicroRNA (miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子,長度為20-24個核苷酸,在物種進化過程中具有高度的保守性。同時,miRNA的表達模式具有分化位相性和時序性,提示該類分子可能是細胞分化和發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子。成熟的miRNA分子是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生,它無法進一步轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì),但是可以與其他蛋白質(zhì)(如Argonaute蛋白和Dicer酶)結(jié)合組裝成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC)。RISC通過堿基互補配對的方式形成miRNA-RISC蛋白復合體,后者與靶基因序列的3'UTR區(qū)進行特異性結(jié)合,根據(jù)miRNA和靶基因轉(zhuǎn)錄體兩者的互補程度不同指導RNA誘導的沉默復合體進行切割I(lǐng)nRNA或阻遏mRNA翻譯,從而參與胚胎早期發(fā)育、增殖、凋亡及分化等重要生命過程[29-34]。生物信息學預測系統(tǒng)的結(jié)果顯示,一個miRNA可以結(jié)合并調(diào)控多個靶基因,而同一個基因又可以同時接受多個miRNA分子的精細調(diào)節(jié),miRNA與其靶基因形成一個復雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡并影響著生命進程的多個環(huán)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn),miRNA可作為原癌基因或抑癌基因參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,如bantam miRNA是第一個被發(fā)現(xiàn)具有原癌基因功能的miRNA。同時,多種腫瘤相關(guān)基因的表達接受miRNA的調(diào)節(jié),Kedmi M等發(fā)現(xiàn)miR-15b可以靶向調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因MTSS 1的表達從而促進乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移；Kim BK等研究結(jié)果顯示miR-199a-5p可以負性調(diào)節(jié)FZD6的表達并參與結(jié)直腸癌的發(fā)生過程[40]；Sun Y等研究結(jié)果表明miR-126可以正向調(diào)節(jié)EGFL7的表達并抑制非小細胞肺癌增殖[41]；Zeng X等研究提示niR-200b可以通過調(diào)節(jié)ZEB2的表達來參與小細胞肺癌多藥耐藥形成過程。miR-495是位于人類染色體14q32.31位點上的一個非編碼RNA分子,已有學者發(fā)現(xiàn)miR-495是胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因子之一,主要參與調(diào)控間充質(zhì)干細胞分化及多種腫瘤的增殖、遷移、侵襲等生物學行為。另外,有研究結(jié)果提示miR-495還參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞對化療藥物的敏感性,Song L等研究發(fā)現(xiàn)miR-495可以通過調(diào)節(jié)非小細胞肺癌中ATP7A的表達影響其對鉑類化療藥物的敏感性;Xu Y等發(fā)現(xiàn)miR-495可以下調(diào)MDR1的表達并參與白血病多藥耐藥的形成。本課題組早期對小細胞肺癌耐藥株和敏感株進行基因芯片分析發(fā)現(xiàn),miR-495在耐藥細胞中表達明顯較敏感株低,并且發(fā)現(xiàn)miR-495可能通過誘導SCLC細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)參與小細胞肺癌耐藥的發(fā)生。生物信息學軟件分析發(fā)現(xiàn),miR-495與TSPAN12存在共同結(jié)合位點,提示TSPAN12可能是miR-495的靶基因之一,后者可能通過靶向TSPAN12參與SCLC多藥耐藥的發(fā)生。Wnt信號轉(zhuǎn)導通路是一類在物種進化過程中高度保守的信號途徑。經(jīng)典的Wnt信號通路主要由Wnt家族分泌蛋白、Frizzled家族跨膜蛋白(FZD)、Dishevelled (Dsh)蛋白、(3-catenin蛋白、P-catenin降解復合體(包括APC蛋白、糖原合成酶激酶GSK3β蛋白、Axin蛋白及β-catenin蛋白)及TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等構(gòu)成。Wnt通路的激活經(jīng)歷以下過程：Wnt蛋白與細胞膜受體結(jié)合后,通過磷酸化的Dsh蛋白將信號傳至細胞內(nèi),抑制β-catenin降解復合體活性,β-catenin活化并在細胞質(zhì)中大量聚集,當β-catenin達到一定水平后向細胞核轉(zhuǎn)位,與TCF/LEF家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。大量研究表明,Wnt信號參與了早期胚胎發(fā)育、器官形成、組織再生及上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等生理過程。然而在視網(wǎng)膜血管形成的研究中,有學者表示β-catenin蛋白的活化可以不依賴Wnt信號。其中Junge H等研究人員發(fā)現(xiàn)TSPAN12分子可以直接與Norrin蛋白結(jié)合,通過聚集并活化FZD4蛋白來抑制β-catenin蛋白的降解過程,β-catenin蛋白在細胞質(zhì)中積聚并進入細胞核內(nèi),從而啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄。已有研究結(jié)果顯示,Wnt/β-catenin信號通路的異�；罨梢哉T導腫瘤發(fā)生。而Knoblich K等研究發(fā)現(xiàn),TSPAN12可誘導P-catenin信號的激活,并提高乳腺癌細胞體內(nèi)成瘤能力。綜上所述,基于前期小細胞肺癌基因芯片結(jié)果,我們提出以下假說,TSPAN12在miR-495的調(diào)控下,通過Norrin/β-catenin信號途徑參與小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展及多藥耐藥。實驗目的通過篩選小細胞肺癌耐藥株(H69AR)和化療敏感株(H69)中具有差異表達的基因,選擇表達顯著上調(diào)的基因TSPAN12進行研究,分析其對癌細胞增殖和藥物敏感性的影響及調(diào)控機制,進一步豐富小細胞肺癌多藥耐藥的分子機制,為臨床治療提供理論依據(jù)。研究內(nèi)容1.分析小細胞肺癌耐藥細胞H69AR和敏感株H69中TSPAN12基因表達的差異性,并取另一對細胞H446/CDDP和H446進行驗證；2.分析TSPAN12對SCLC癌細胞藥物敏感性和增殖的影響；3.分析SCLC耐藥細胞H69AR和敏感株H69中miR-495的表達差異性及其對TSPAN12的調(diào)節(jié)作用；4.分析TSPAN12對β-catenin信號通路活化的影響。研究方法：1.cDNA基因芯片分析SCLC多藥耐藥細胞H69AR和敏感株H69中具有差異表達的基因,選擇tetraspanin家族中表達顯著差異的TSPAN12,通過實時熒光定量PCR (qRT-PCR)和western blotting技術(shù)驗證TSPAN12在兩株細胞中mRNA和蛋白水平上的表達差異；取另一對細胞(I1446/CDDP、H446)共同驗證基因芯片的結(jié)果。2.利用shRNA降低SCLC耐藥株H69AR和H446/CDDP中TSPAN12表達水平,CCK-8法分析癌細胞對小細胞肺癌常用化療藥物順鉑(Cisplatin, DDP)和足葉乙甙(Etoposide, VP-16)的敏感性變化；分別利用CCK-8法和平板克隆實驗分析下調(diào)TSPAN12表達后H446/CDDP細胞的增殖變化；流式細胞術(shù)分析shRNA轉(zhuǎn)染前后細胞凋亡和周期的變化。3.利用miRNA芯片技術(shù)分析SCLC耐藥細胞H69AR和敏感株H69中差異表達的nicroRNA,通過生物信息學軟件(microRNA.org)分析TSPAN12相關(guān)miRNA,選擇表達差異顯著的miR-495進行研究,通過qRT-PCR技術(shù)驗證H69AR、H446/CDDP及其相應親本中miR-495的表達差異性。4.通過構(gòu)建miR-495 mimics和miR-495 inhibitors增加或抑制耐藥株(H69AR、 H446/CDDP)及其親本細胞中miR-495的表達水平,利用qRT-PCR技術(shù)驗證轉(zhuǎn)染效果,然后分別利用qRT-PCR和vvestern blotting技術(shù)在mRNA和蛋白水平檢驗轉(zhuǎn)染后細胞中TSPAN12基因表達的情況。5.利用qRT-PCR和western blotting技術(shù)分析下調(diào)TSPAN12后SCLC細胞H446/CDDP中P-catenin在mRNA和蛋白水平上的表達變化；通過免疫熒光實驗分析下調(diào)TSPAN12前后細胞中β-catenin的分布情況。統(tǒng)計學分析：實驗結(jié)果均經(jīng)SPSS 13.0軟件統(tǒng)計。各實驗至少獨立重復3次,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(x±s)表示。耐藥株及其親本間TSPAN12或miR-495表達的比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間細胞周期或凋亡比較采用one-way ANOVA(方差齊同時)或Welch法(方差不齊時),多重比較采用Dunn ett法(方差齊同時)或Dunnett's T3法(方差不齊時)。CCK-8實驗結(jié)果采用析因設計資料的方差分析,多重比較采用SNK法。以P0.05表示有統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果：1.cDNA芯片結(jié)果顯示TSPAN12在SCLC耐藥株H69AR中的表達是敏感株H69中的3.15倍,(RT-PCR結(jié)果(4.66倍,P=0.033)和western blotting結(jié)果(1.50倍,P=0.01)；在H446/CDDP和H446細胞中qRT-PCR結(jié)果(2.15倍,P=0.028)和、vestern blotting檢測(1.77倍,P0.001),驗證了基因芯片的結(jié)果。2.設計針對TSPAN12的shRNA寡核苷酸,利用lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染H446/CDDP細胞,提取總RNA和總蛋白,qRT-PCR實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染TSPAN12-1082和TSPAN12-748后細胞中TSPAN12 mRNA水平分別下降至原來的28.6667%(P0.001)和65.333%(P=0.019),結(jié)果與western blotting的一致,選取轉(zhuǎn)染TSPAN12-1082進行后續(xù)實驗。3.CCK-8法分析癌細胞藥物敏感性結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染TSPAN12-1082后H69AR和H446/CDDP對化療藥物(順鉑和足葉乙甙)的生存率下降,IC50值亦相應減小,但P0.05,沒有統(tǒng)計學差異。4.CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染TSPAN12-1082后H446/CDDP細胞在不同時間點生存率的變化,結(jié)果顯示TSPAN12下調(diào)后H446/CDDP細胞增殖速率顯著減慢(P0.05)；進一步通過平板克隆實驗進行驗證,顯示TSPAN12下調(diào)后細胞形成克隆能力顯著下降(P=-0.022)。5.利用流式細胞術(shù)對轉(zhuǎn)染TSPAN12-1082后H446/CDDP細胞周期的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSPAN12下調(diào)可引起細胞發(fā)生G0/G1期阻滯(P=0.01)；在細胞凋亡方面,下調(diào)TSPAN12可促進藥物對細胞誘導的凋亡(P-=0.002)。6.利用miRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)SCLC多藥耐藥株H69AR中miR-495較敏感株I-169中的明顯下調(diào)(后者約為前者的4.51倍),qRT-PCR結(jié)果(0.32667倍,P=0.017),取H446/CDDP和H446細胞共同驗證,qRT-PCR結(jié)果(0.24667倍,P=0.016),芯片結(jié)果得以驗證。7.利用microRNA靶基因預測軟件檢測發(fā)現(xiàn)miR-495的基因序列能與TSPAN12 mRNA的3’-UTR部分互補配對,轉(zhuǎn)染miR-495mimics后H69AR細胞中miR-495表達上調(diào)3.31倍(P=-0.018),qRT-PCR示TSPAN12下調(diào)至其親本的0.67倍(P=0.045),蛋白水平上TSPAN12下調(diào)0.57倍(P0.001)；而轉(zhuǎn)染miR-495 inhibitors后H69細胞中miR-495表達下調(diào)至0.42倍(P--0.017),TSPAN12在mRNA水平上增加4.76倍(P=-0.018),蛋白水平上增加2.58倍(P0.001)；在H446/CDDP和H446細胞中重復相同實驗也得到類似結(jié)果。8.H446/CDDP轉(zhuǎn)染TSPAN12-1082后,通過qRT-PCR檢測,結(jié)果顯示中β-catenin及其下游基因MYC和CyclinD1表達分別下調(diào)0.47倍、0.48倍及0.38倍(P0.05), western blotting結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染TSPAN12后β-cateni n下調(diào)0.72倍(P0.05)；在H69和H69AR細胞中重復相同實驗得到一致的結(jié)果。免疫熒光實驗顯示TSPAN12下調(diào)后細胞核內(nèi)分布的β-catenin蛋白減少。結(jié)論：1. TSPAN12在SCLC多藥耐藥細胞H69AR中表達上調(diào),降低細胞中TSPAN12的表達可以增加癌細胞對化療藥物的敏感性并抑制癌細胞增殖,提示TSPAN12可能是小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展的一個促癌因子,但不是調(diào)節(jié)小細胞肺癌耐藥的關(guān)鍵因素。2. TSPAN12可以影響SCLC癌細胞周期及其對化療藥物誘導的細胞凋亡。3.miR-495在SCLC多藥耐藥細胞H69AR中表達下調(diào),降低或增加miR-495可以下調(diào)或上調(diào)TSPAN12的表達,提示TSPAN12可能是miR-495的靶基因。4.降低TSPAN12在癌細胞中的表達可以下調(diào)P-catenin及其下游基因的表達,并抑制β-catenin蛋白向細胞核轉(zhuǎn)移,提示TSPAN12可能通過活化β-catenin信號通路來影響SCLC的增殖和凋亡等過程。
【關(guān)鍵詞】：TSPAN12 SCLC 多藥耐藥 miR-495
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-20
• 第一部分 TSPAN12對小細胞肺癌增殖和耐藥性的作用20-56
• 第一章 前言20-22
• 第二章 材料和方法22-47
• 第三章 結(jié)果47-54
• 第四章 討論54-56
• 第二部分 miR-495對TSPAN12的調(diào)節(jié)作用56-63
• 第一章 前言56-59
• 第二章 材料和方法59
• 第三章 結(jié)果59-62
• 第四章 討論62-63
• 第三部分 TSPAN12與β-catenin信號通路的關(guān)系63-70
• 第一章 前言63-65
• 第二章 材料與方法65-66
• 第三章 結(jié)果66-69
• 第四章 討論69-70
• 全文小結(jié)70-71
• 參考文獻71-79
• 攻讀學位期間成果79-80
• 中英文縮寫詞對照表80-81
• 致謝81-82

【共引文獻】

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本文編號：738939