本文關(guān)鍵詞：IncRNA UCA1在胃癌中的作用及胃癌血漿RNA腫瘤標(biāo)志物的篩選研究

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【摘要】：腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類生存健康的疾病，具有難于發(fā)現(xiàn)、生長迅速等特點。雖然關(guān)于癌癥的相關(guān)研究在不斷進(jìn)步和深化，，但到目前為止仍然缺乏有效的治療手段。胃癌作為亞洲地區(qū)高發(fā)的消化道腫瘤，其治愈率、5年以上存活率均很低，常規(guī)手術(shù)治療后患者的生存質(zhì)量也很難保證。越來越多的研究表明，RNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，無論是作為腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要元素還是作為外周血腫瘤生物標(biāo)志物，都很值得研究和探討。 本研究分為三個部分：第一部分重點研究利用芯片技術(shù)篩選出的胃癌組織與正常組織差異表達(dá)的lncRNA UCA1，該lncRNA在膀胱癌、乳腺癌等多種腫瘤中都被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)，但在胃癌中還是沒有相關(guān)報道的。我們利用實時定量PCR技術(shù)檢測了32對胃癌臨床樣本中UCA1的表達(dá)情況，證實UCA1在胃癌腫瘤組織中高表達(dá)，體外細(xì)胞實驗則證實UCA1的異常表達(dá)影響胃癌細(xì)胞系的增殖和克隆形成能力，對胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期和細(xì)胞耐藥等方面均有影響�？拱┧幬锇⒚顾厥刮赴┘�(xì)胞中UCA1表達(dá)上調(diào)，這種上調(diào)與p53相關(guān)。第二部分篩選血漿中作為胃癌腫瘤標(biāo)志物的候選RNA分子。通過轉(zhuǎn)錄組芯片分析健康人和胃癌患者血漿中RNA的差異表達(dá)譜，采用實時定量PCR對大樣本分析結(jié)果表明RGS18、ITM2B、PPBP、NAP1L1的mRNA和n324674、 ENST00000442382非編碼RNA在胃癌患者的血漿中較對照健康人群表達(dá)變化顯著。上述RNA的AUC分別為0.6609、0.6037、0.6499、0.5743、0.7096、0.6801，其聯(lián)合檢測AUC為0.7722，高于胃癌檢測標(biāo)志物CEA的0.5370和CA724的0.5845，是潛在的胃癌檢測血漿標(biāo)志物分子。第三部分建立并優(yōu)化了一種血漿中miRNA的提取方法，為血漿中腫瘤標(biāo)志物miRNA分子檢測提供了新方法。 本研究探討了lncRNA UCA1在胃癌細(xì)胞中的作用和在阿霉素作用下UCA1表達(dá)上調(diào)的原因，UCA1在胃癌中的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探究；探討了血漿中RNA做為胃癌標(biāo)志物的可行性，成功的建立并優(yōu)化了一種快速提取血漿中miRNA的方法。上述研究結(jié)果為闡釋非編碼RNA在為胃癌中的作用，以及胃癌血漿RNA標(biāo)志物的研究提供了線索。 腫瘤作為醫(yī)療界世界性的難題，嚴(yán)重威脅人類的身體健康。胃癌是亞洲地區(qū)乃至世界范圍內(nèi)最高發(fā)的腫瘤之一，并且擁有居高不下的致死率，臨床上缺乏有效的診療手段，手術(shù)治療后患者生存質(zhì)量差，5年內(nèi)存活率低。因此研究其致病機(jī)制，尋找有效的生物治療靶點，并開發(fā)出既簡便易行又準(zhǔn)確率高的生化檢驗診斷方法刻不容緩。LncRNA作為腫瘤機(jī)制研究中新的明星分子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用，當(dāng)前關(guān)于胃癌中l(wèi)ncRNA的研究并不多見，因此研究胃癌中的lncRNA為胃癌的研究和治療拓展了新的視野。另一方面，當(dāng)前胃癌診斷缺少針對性強(qiáng)、靈敏度特異性高的生化檢驗標(biāo)志物，外周血中的R NA作為新一代腫瘤生物標(biāo)志物正迅速的發(fā)展起來，尋找有效的腫瘤標(biāo)志物選擇方法并篩選出高靈敏度、高準(zhǔn)確性的外周血R NA腫瘤標(biāo)志物就顯得尤為重要。 在本研究的第一部分，利用基因表達(dá)譜測序法和實時定量PCR法尋找到在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用的lncRNA UCA1，之后利用CCK 8實驗、克隆形成實驗、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實驗及耐藥性實驗等探究U CA1在胃癌細(xì)胞中的功能，并發(fā)現(xiàn)在阿霉素刺激下，細(xì)胞中的U CA1表達(dá)量會上調(diào)，而這種上調(diào)是通過p53實現(xiàn)的；在本研究的第二部分，利用先進(jìn)的芯片技術(shù)，對健康對照組和胃癌患者組血漿中差異表達(dá)的R NA進(jìn)行分析，針對初步篩選出的R NA擴(kuò)大樣本量利用實時定量法檢測，并在性別、年齡、腫瘤分期、瘤體體積等層面進(jìn)行分析，同時分析了篩選出的RNA作為腫瘤標(biāo)志物的靈敏性和特異性，并與現(xiàn)有的臨床診斷標(biāo)志物進(jìn)行比較，在腫瘤組織中也檢驗了這些RNA的表達(dá)情況，顯示血漿中的R NA差異可能不是來源于腫瘤組織；本研究的第三部分則是建立并優(yōu)化了一種新的血漿中R NA提取方法，該方法較之前廣泛使用的方法而言，更快捷、成本更低，并且提取效果有很好的保障。 實驗探究了U CA1在胃癌細(xì)胞中的功能；利用新的篩選手段篩選出了胃癌血漿中新的RNA腫瘤標(biāo)志物；建立并優(yōu)化了新的血漿R NA提取方法。為關(guān)于胃癌的lncRNA研究、血漿診療標(biāo)志物的選擇提供了實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 UCA1 血漿 提取
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 英文縮寫注釋表4-5
• 內(nèi)容提要5-11
• 第一部分 lncRNA UCA1 在胃癌中的作用11-36
• 第一章 引言11-17
• 1.1 生命過程中的長鏈非編碼 RNA11-12
• 1.1.1 長鏈非編碼 RNA 簡介11
• 1.1.2 lncRNA 的生物學(xué)功能11-12
• 1.2 lncRNA 與疾病12-15
• 1.2.1 腫瘤中的 lncRNA12-15
• 1.2.1.1 多種腫瘤中的 lncRNA13-14
• 1.2.1.2 胃癌中的 lncRNA14-15
• 1.2.2 其他疾病中的 lncRNA15
• 1.3 lncRNA UCA1 與胃癌的發(fā)生15
• 1.4 本研究的立題目的和意義15-17
• 第二章 實驗研究17-28
• 2.1 實驗材料17-21
• 2.1.1 組織樣本與臨床資料17
• 2.1.2 細(xì)胞株和質(zhì)粒17
• 2.1.3 引物和 siRNA 序列17-18
• 2.1.4 主要試劑與溶液18-20
• 2.1.4.1 主要試劑18-19
• 2.1.4.2 主要溶液19-20
• 2.1.5 實驗所用儀器設(shè)備20-21
• 2.1.6 計算機(jī)輔助工具21
• 2.2 實驗方法21-28
• 2.2.1 lncRNA 芯片分析21
• 2.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建21-23
• 2.2.2.1 UCA1 表達(dá)載體構(gòu)建21-23
• 2.2.2.2 PGL3-UCA1 系列質(zhì)粒的構(gòu)建23
• 2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染23-24
• 2.2.4 組織及細(xì)胞總 RNA 的提取和實時定量 PCR24-25
• 2.2.5 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖和克隆形成實驗25-26
• 2.2.6 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移實驗26
• 2.2.7 細(xì)胞周期檢測26
• 2.2.8 western-blot 實驗26-27
• 2.2.9 CCK-8 檢測細(xì)胞耐藥性27
• 2.2.10 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/span>27-28
• 第三章 實驗結(jié)果28-34
• 3.1 胃癌組織的 lncRNA 芯片分析及實時定量 PCR 驗證28
• 3.2 胃癌細(xì)胞中 UCA1 的作用研究28-31
• 3.2.1 UCA1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建28-29
• 3.2.2 UCA1 促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖29-30
• 3.2.3 UCA1 促進(jìn)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力30
• 3.2.4 在 PHM82 細(xì)胞系中干涉 UCA1，細(xì)胞發(fā)生 G2/M 期阻滯30
• 3.2.5 UCA1 對細(xì)胞耐阿霉素作用的影響30-31
• 3.3 阿霉素的加入誘發(fā) UCA1 表達(dá)量提高的作用機(jī)制研究31-34
• 第四章 討論34-35
• 第五章 結(jié)論35-36
• 第二部分 胃癌血漿中 RNA 腫瘤標(biāo)志物的篩選36-51
• 第一章 引言36-38
• 1.1 血漿腫瘤標(biāo)志物36
• 1.2 外周血循環(huán) RNA 作為腫瘤標(biāo)志物的概述36
• 1.3 胃癌血漿腫瘤標(biāo)志物現(xiàn)狀36-37
• 1.4 本研究的立題目的和意義37-38
• 第二章 實驗研究38-42
• 2.1 實驗材料38-39
• 2.1.1 血漿樣本及組織樣本38
• 2.1.2 引物設(shè)計38-39
• 2.1.3 主要試劑和溶液39
• 2.1.4 實驗所用儀器設(shè)備39
• 2.1.5 計算機(jī)輔助工具39
• 2.2 實驗方法39-42
• 2.2.1 血漿標(biāo)本的 RNA 提取和轉(zhuǎn)錄組芯片分析39-40
• 2.2.2 血漿標(biāo)本和組織樣本的 RNA 提取和實時定量 PCR 檢測40-42
• 第三章 實驗結(jié)果42-49
• 3.1 胃癌血漿中差異表達(dá)的 RNA 分析42-48
• 3.2 候選差異表達(dá) RNA 在胃癌組織中的表達(dá)情況分析48
• 3.3 血漿中同一基因不同片段分布的初步分析48-49
• 第四章 討論49-50
• 第五章 結(jié)論50-51
• 第三部分 血漿 miRNA 快速制備方法建立和優(yōu)化51-60
• 第一章 引言51-52
• 第二章 實驗研究52-54
• 2.1 實驗材料52
• 2.2 實驗方法52-54
• 2.2.1 提取液52
• 2.2.2 血漿 miRNA 提取52
• 2.2.3 RNA 加尾和反轉(zhuǎn)錄52-53
• 2.2.4 實時定量 PCR53-54
• 第三章 實驗結(jié)果54-58
• 3.1 提取液法提取血漿 miRNA 方法的建立和優(yōu)化54-56
• 3.2 提取液法提取血漿 miRNA 重復(fù)性分析56
• 3.3 不同血漿用量對提取液法提取 miRNA 的影響56-58
• 第四章 討論58-59
• 第五章 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-69
• 中文摘要69-71
• Abstract71-73
• 作者簡介73-74
• 致謝74-75
• 附錄1 ：胃癌組織樣本資料匯總75-76
• 附錄2 ：芯片檢測血漿中R NA所用樣本資料總匯76-78
• 附錄3 ：實時定量檢測血漿中R NA樣本資料總匯78-83

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