本文關(guān)鍵詞：鼻咽癌靶向基因傳遞載體的研究

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【摘要】：隨著近年來(lái)腫瘤發(fā)病率的不斷提升，惡性腫瘤對(duì)人類(lèi)構(gòu)成了極大的威脅。鼻咽癌是原發(fā)于鼻咽粘膜上皮的惡性腫瘤，對(duì)大多數(shù)地區(qū)而言，鼻咽癌是一種發(fā)病率較低的腫瘤，然而卻是我國(guó)常見(jiàn)的腫瘤之一。常用的癌癥治療手段在鼻咽癌晚期的治療上收效并不高，鼻咽癌的基因治療方法的建立可以為傳統(tǒng)療法提供必要的補(bǔ)充，具有重要意義。其中，有效的治療基因、安全且體液條件下轉(zhuǎn)染效率高的傳遞載體是有待解決的兩個(gè)關(guān)鍵限制因素。 本課題在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，采用葉酸為導(dǎo)向分子，將陽(yáng)離子脂質(zhì)體、PEI和NLS等提高轉(zhuǎn)染的特殊功能相聯(lián)合，利用改進(jìn)的新方法制備靶向鼻咽癌的多功能基因傳遞載體。 首先考察TRAIL基因?qū)τ诒茄拾┘?xì)胞的殺傷作用。通過(guò)對(duì)細(xì)胞表面TRAIL受體進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞凋亡狀態(tài)觀察，MTT檢測(cè)最終確定TRAIL可誘導(dǎo)人鼻咽癌CNE、HNE-1細(xì)胞的凋亡，達(dá)到殺傷癌細(xì)胞目的，可以作為鼻咽癌基因治療的候選基因。 將NLS以不同比例分別與PEI和陽(yáng)離子脂質(zhì)體形成復(fù)合載體，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NLS在適當(dāng)?shù)膬?yōu)化比例下可顯著提高非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。 改進(jìn)脂質(zhì)體、PEI、DNA的復(fù)合方法，從實(shí)驗(yàn)室前期建立的二步復(fù)合法優(yōu)化為一步復(fù)合。采用優(yōu)化后的一步法制備得到粒徑150nm左右、表面電位45mV左右的PEIlip/DNA復(fù)合物。細(xì)胞轉(zhuǎn)染和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEIlip/DNA具有良好的安全性和更高的轉(zhuǎn)染效率，，且轉(zhuǎn)染不受血清的影響。 ELISA檢測(cè)證明鼻咽癌CNE、HNE-1細(xì)胞表面高表達(dá)葉酸受體，為葉酸作為鼻咽癌基因傳遞載體的導(dǎo)向分子提供理論依據(jù)。制備熒光標(biāo)記的葉酸修飾脂質(zhì)體，熒光顯微鏡下觀察到其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE具有靶向識(shí)別和入胞的功能。 制備葉酸修飾的fPEG-PEIlip/DNA復(fù)合物，細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葉酸修飾可以顯著提高復(fù)合物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，而NLS的加入能夠進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率。。 綜上所述，本文成功的制備了一種可以靶向鼻咽癌基因傳遞載體，該載體安全性好、轉(zhuǎn)染效率高體，是一種具有應(yīng)用潛力的鼻咽癌基因治療載體。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 基因傳遞載體 靶向脂質(zhì)體 PEI NLS
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文縮寫(xiě)詞表8-11
• 第一章 前言11-21
• 1.1 腫瘤的基因治療11-12
• 1.2 TRAIL 治療基因12-16
• 1.3 非病毒載體16-20
• 1.3.1 陽(yáng)離子脂質(zhì)體載體16-17
• 1.3.2 聚乙烯亞胺（polyethylenimine, PEI）17-18
• 1.3.3 核定位肽18-19
• 1.3.4 葉酸19-20
• 1.4 立題依據(jù)及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)20-21
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法21-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑、儀器21-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、菌株、質(zhì)粒21
• 2.1.2 主要試劑、材料21-22
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-31
• 2.2.1 質(zhì)粒 DNA 的轉(zhuǎn)化、提取、質(zhì)量檢測(cè)23
• 2.2.2 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、凍存23-24
• 2.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)24-25
• 2.2.4 細(xì)胞表面 TRAIL 受體檢測(cè)25
• 2.2.5 NLS/DNA 復(fù)合物的制備25
• 2.2.6 復(fù)合物粒徑及電位的測(cè)定25-26
• 2.2.7 瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)26
• 2.2.8 lipo2000/NLS/DNA 復(fù)合物的制備26
• 2.2.9 PEI/NLS/DNA 的制備26
• 2.2.10 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率考察26-27
• 2.2.11 細(xì)胞毒性檢測(cè)27-28
• 2.2.12 PEI/DNA 復(fù)合物的制備28
• 2.2.13 陽(yáng)離子脂質(zhì)體/PEI/DNA 復(fù)合物的制備28
• 2.2.14 PEIlip 的制備28-29
• 2.2.15 PEIlip/NLS/DNA 的制備29
• 2.2.16 細(xì)胞表面葉酸受體檢測(cè)29-30
• 2.2.17 熒光葉酸脂質(zhì)體的制備及考察30
• 2.2.18 葉酸脂質(zhì)體的制備及性質(zhì)考察30
• 2.2.19 葉酸脂質(zhì)體/PEI/NLS/DNA 復(fù)合物的制備30
• 2.2.20 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析30-31
• 第三章 結(jié)果與討論31-50
• 3.1 TRAIL 基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞的促凋亡作用考察31-34
• 3.1.1 CNE、HNE-1 細(xì)胞膜表面 TRAIL 受體的檢測(cè)31-32
• 3.1.2 TRAIL 基因?qū)?CNE 細(xì)胞的促凋亡作用評(píng)價(jià)32-34
• 3.2 NLS 的促轉(zhuǎn)染作用34-40
• 3.2.1 NLS/DNA 復(fù)合物的性質(zhì)及制備考察34-35
• 3.2.2 NLS 對(duì) PEI/DNA 的促轉(zhuǎn)染作用35-38
• 3.2.3 NLS 對(duì) lipo2000/DNA 的促轉(zhuǎn)染作用38-39
• 3.2.4 小結(jié)39-40
• 3.3 陽(yáng)離子脂質(zhì)體與 PEI 復(fù)合載體制備方法改進(jìn)及性質(zhì)考察40-45
• 3.3.1 N/P 的影響40-41
• 3.3.2 超聲與過(guò)膜處理對(duì) PEIlip/DNA 復(fù)合物的影響41-43
• 3.3.3 兩種方法制備三元復(fù)合物性質(zhì)比較43-44
• 3.3.5 小結(jié)44-45
• 3.4 葉酸修飾復(fù)合物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的靶向作用45-50
• 3.4.1 細(xì)胞表面葉酸受體 ELLSA 檢測(cè)45
• 3.4.2 葉酸脂質(zhì)體的靶向作用45-47
• 3.4.3 葉酸修飾三元復(fù)合載體的靶向性47-49
• 3.4.4 小結(jié)49-50
• 全文總結(jié)50-51
• 參考文獻(xiàn)51-59
• 作者簡(jiǎn)介59-60
• 致謝60

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

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本文編號(hào)：723854