本文關(guān)鍵詞：ART1對(duì)uPA基因啟動(dòng)子甲基化影響在小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用

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【摘要】：目的：探究精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化轉(zhuǎn)移酶-1(Arginine-specific mono-ADP-ribosytransferases-1, ART1)對(duì)uPA基因啟動(dòng)子甲基化的影響及其在小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。方法：本實(shí)驗(yàn)以CT26細(xì)胞ART1高表達(dá)組(GFP-ART1)、ART1沉默組(GFP-shARTl)為實(shí)驗(yàn)組,CT26細(xì)胞空載體組(GFP-Vector組)、未轉(zhuǎn)染組(Un-transfection組)為對(duì)照組,western blot測(cè)定不同組別DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)表達(dá)變化,同時(shí),ART1高表達(dá)組、ART1沉默組、空載體組及未轉(zhuǎn)染組CT26細(xì)胞分別接種于BALB/C小鼠,構(gòu)建各組別BALB/C小鼠脾臟移植瘤模型并提取各組移植瘤組織蛋白,Western blot測(cè)定不同組別DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)表達(dá)變化。DNA甲基化特異性PCR測(cè)序法檢測(cè)不同組別uPA基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)變化；免疫共沉淀方法觀察CT26細(xì)胞ART1高表達(dá)組、空載體組及未轉(zhuǎn)染組ART1與DNMT1之間的關(guān)系。應(yīng)用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-雜氮-2-脫氧胞苷(5-aza-2-dc)處理ART1沉默組CT26細(xì)胞,劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化。BALB/C小鼠脾臟接種ART1基因沉默CT26細(xì)胞,腹腔注射5-aza-2-dc,與對(duì)照組比較小鼠脾臟移植瘤細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移情況。采用western blot檢測(cè)GFP-shARTl、GFP-ART1、Un-transfection及GFP-Vector各組腫瘤細(xì)胞uPA表達(dá)變化,同時(shí)檢測(cè)各組細(xì)胞脾臟移植瘤uPA表達(dá)變化,并應(yīng)用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2-dc處理ART1沉默組CT26細(xì)胞,western blot方法檢測(cè)其uPA表達(dá)變化,同時(shí)檢測(cè)5-aza-2-dc處理沉默組與未處理沉默組脾臟移植瘤uPA表達(dá)變化。結(jié)果：(1)ARTl對(duì)小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞uPA基因啟動(dòng)子甲基化水平的影響：western blot方法檢測(cè)ART1高表達(dá)組、ART1沉默組、未轉(zhuǎn)染組、空載體組CT26細(xì)胞DNMT1表達(dá)變化,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,ART1高表達(dá)組DNMT1表達(dá)減少,而ART1沉默組DNMT1表達(dá)增加(P0.01)；同時(shí)檢測(cè)各組小鼠脾臟移植瘤蛋白中DNMT1表達(dá)變化,結(jié)果顯示同樣的趨勢(shì)(P0.01)；采用DNA甲基化特異性PCR測(cè)序方法測(cè)定uPA啟動(dòng)子甲基化水平在各組的變化,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,ART1高表達(dá)組uPA基因啟動(dòng)子甲基化水平降低,而ART1沉默組uPA基因啟動(dòng)子甲基化水平升高。免疫共沉淀結(jié)果顯示ART1與DNMT1之間尚未發(fā)生直接的結(jié)合。(2)ARTl通過(guò)對(duì)uPA基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的影響導(dǎo)致其表達(dá)變化及其在小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的作用：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5-aza-2-dc處理組和未處理組CT26沉默細(xì)胞遷移及侵襲能力,結(jié)果顯示與未處理組相比,5-aza-2-dc處理組細(xì)胞24h遷移距離明顯增高(P0.01),且降解Matrigel基質(zhì)膠穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)明顯升高(P0.01)。采用5-aza-dc處理沉默組CT26細(xì)胞構(gòu)建小鼠脾臟移植瘤模型,觀察小鼠肝轉(zhuǎn)移情況,結(jié)果顯示與未處理組相比,處理組小鼠肝轉(zhuǎn)移模型的肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)(P0.05)和肝臟重量顯著增加(P0.05)。采用western blot方法檢測(cè)ARTl高表達(dá)組,ART1沉默組,未轉(zhuǎn)染組,空載體組CT26細(xì)胞uPA表達(dá)變化,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,GFP-ART1組uPA表達(dá)增加,而GFP-shART1組uPA表達(dá)減少(P0.01)；同時(shí)檢測(cè)各組小鼠脾臟移植瘤蛋白中uPA表達(dá)變化,結(jié)果顯示同樣的趨勢(shì)(P0.01)；采用5-aza-2-dc處理沉默組細(xì)胞后,顯示uPA表達(dá)增加(P0.01)；同時(shí)western blot方法檢測(cè)5-aza-2-dc處理組與未處理組CT26沉默細(xì)胞移植瘤蛋白結(jié)果顯示,與未處理組相比,uPA表達(dá)顯著增加(P0.01)。結(jié)論：ART1沉默能夠促進(jìn)DNMT1表達(dá),促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因uPA啟動(dòng)子高甲基化,引起uPA蛋白表達(dá)減少,相反ART1高表達(dá),則使DNMT1表達(dá)降低,uPA啟動(dòng)子甲基化程度降低,其蛋白表達(dá)增加,同時(shí),抑制DNMT1, uPA基因蛋白表達(dá)增加,CT26細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng),提示ARTl可通過(guò)抑制uPA基因啟動(dòng)子甲基化,而促進(jìn)其表達(dá),從而在小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進(jìn)作用。其詳細(xì)的機(jī)制仍有待深入探究。
【關(guān)鍵詞】：精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化轉(zhuǎn)移酶-1 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1 DNA甲基化 侵襲 轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.35
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 第一部分 ART1對(duì)UPA基因啟動(dòng)子甲基化的影響15-25
• 1 實(shí)驗(yàn)材料15-16
• 2 實(shí)驗(yàn)方法16-21
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-22
• 4 討論22-25
• 第二部分 ART1對(duì)UPA基因啟動(dòng)子甲基化影響在小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用25-35
• 1 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 2 實(shí)驗(yàn)方法26-28
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-33
• 4 討論33-35
• 全文總結(jié)35-37
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 附圖41-42
• 文獻(xiàn)綜述42-48
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 致謝48-49
• 碩士期間發(fā)表論文情況49

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8 李U，

本文編號(hào)：716712