本文關鍵詞：RRBS數(shù)據分析新流程的建立及其在腫瘤細胞中等位基因特異甲基化分析的應用

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【摘要】：DNA甲基化是非常重要的表觀遺傳修飾之一,在胚胎發(fā)育、細胞分化、X染色體失活、基因組印記、腫瘤發(fā)生等方面扮演著重要的角色。DNA甲基化譜式異常是腫瘤的重要特征之一,目前在大部分腫瘤細胞中都發(fā)現(xiàn)了整體的DNA甲基化水平降低和部分區(qū)域的甲基化水平增高,但具體的DNA甲基化異常的分子機制目前尚不清楚。簡化的有代表性的重亞硫酸鹽測序(RRBS)技術是近年來發(fā)明的全基因組水平的DNA甲基化分析技術,但是因為其數(shù)據分析的復雜性,現(xiàn)有的分析軟件不能完全滿足研究的需要。起始性DNA甲基轉移酶DNMT3A在腫瘤細胞DNA甲基化譜式異常中的作用并不清楚,我們利用RRBS技術檢測了在肺癌細胞A549中過表達DNMT3A之后基因組DNA甲基化的譜式變化。通過完善數(shù)據分析流程后,我們發(fā)現(xiàn)過表達DNMT3A之后,基因組DNA整體甲基化上升了9.1%,并且這種上升在不同基因特征區(qū)域間沒有顯著差異。另外,起始性的DNA甲基化變化比例并不高,更多的是已有甲基化水平的少量上升,而且重復序列的甲基化水平也呈現(xiàn)與整體相當?shù)纳仙＿M一步區(qū)域分析發(fā)現(xiàn),過表達DNMT3A導致一些基因啟動子區(qū)起始性的高甲基化,包括了RFPL3、 TFAP2E等,可能參與抑制腫瘤細胞的生長。以上結果顯示DNMT3A在腫瘤細胞中參與DNA甲基化水平維持,并能調控一些腫瘤相關基因的啟動子區(qū)甲基化水平。接下來,我們開發(fā)了單個分子連續(xù)CpG甲基化連鎖分析方法,并加入了DNA甲基化與單核苷酸多態(tài)性連鎖分析以及DNA甲基化與基因表達相關性分析。利用這些分析手段,我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞系中普遍存在等位基因特異的DNA甲基化(ASM)。為了明確這些ASM的具體特征,我們在多種腫瘤細胞系中進行了RRBS檢測和數(shù)據分析,同時比較了3個公開的人類胎盤RRBS數(shù)據,結果發(fā)現(xiàn)這些ASM除了已知的印記基因和X染色體失活相關的區(qū)域外,存在著大量的功能未知的基因組區(qū)域。但是,與胎盤中的結果不同,不同腫瘤細胞中的這些ASM沒有共同性,提示其可能只是腫瘤DNA甲基化譜式紊亂的一種表現(xiàn)。為了進一步分析ASM產生和維持的分子機制,我們在腫瘤細胞系中改變維持性或起始性的DNA甲基化系統(tǒng),包括過表達UHRF1、抑制表達UHRF1和過表達DNMT3A,并引入了DNMT3A基因與組蛋白互作結構域的突變體。通過RRBS檢測結合數(shù)據分析流程,我們發(fā)現(xiàn)UHRF1對于ASM的維持是必須的,而新ASM的產生則需要DNMT3A介導,這種介導與DNMT3A結合組蛋白未修飾H3K4有關。當DNMT3A突變體結合甲基化的H3K4或者不結合H3K4時,產生的新ASM顯著增多,推測是導致了起始性的DNA甲基化所致。最后,我們結合了腫瘤細胞RNAseq的基因表達數(shù)據,發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中的這些ASM與基因表達無明顯的相關性。綜合以上結果,腫瘤細胞中新發(fā)現(xiàn)的ASM與DNA甲基化維持和起始系統(tǒng)相關,但是不具有明確的調控基因表達功能,各種腫瘤細胞特異性極大,可能是腫瘤細胞DNA甲基化譜式紊亂的一種新的特征,是DNA甲基化化酶功能不足的一種表現(xiàn),進一步的分子機制可以結合臨床腫瘤樣本開展。綜上所述,本研究開發(fā)并完善了RRBS檢測的數(shù)據分析流程,發(fā)現(xiàn)DNMT3A在腫瘤細胞中參與DNA甲基化譜式異常調控的證據；同時發(fā)現(xiàn)了腫瘤細胞系中大量新的ASM,并對他們的特征與功能進行了初步分析。本研究建立的分析流程可以應用到更多的DNA甲基化調控機制研究中去,本研究的結果可以為進一步闡明腫瘤細胞中DNA甲基化譜式紊亂的分子機制提供幫助。
【關鍵詞】：RRBS 腫瘤 DNA甲基化 DNMT3A UHRF1 ASM
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 第一章 文獻綜述14-22
• 1 DNA甲基化研究進展14-16
• 1.1 DNA甲基化14-15
• 1.2 DNA甲基化酶15
• 1.3 DNA去甲基化15-16
• 2 DNA甲基化檢測方法16-18
• 2.1 高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)17
• 2.2 免疫共沉淀法17
• 2.3 基于重亞硫酸鹽處理法17-18
• 3 DNA甲基化數(shù)據分析18-21
• 3.1 DNA甲基化數(shù)據比對18-19
• 3.2 差異甲基化分析及可視化19-21
• 4 研究目的與意義21-22
• 第二章 RRBS傳統(tǒng)分析流程的建立及其在A549過表達DNMT3A的RRBS數(shù)據分析中的應用22-43
• 1 引言22-23
• 2. 實驗材料23-24
• 2.1 細胞株23
• 2.2 實驗試劑或試劑盒23-24
• 2.3 實驗儀器24
• 3 實驗和數(shù)據分析方法24-32
• 3.1 RRBS文庫的構建24-29
• 3.1.1 細胞基因組DNA的提取24
• 3.1.2 MSPI酶切反應24
• 3.1.3 使用Axygen PCR清潔試劑盒純化24-25
• 3.1.4 末端修復25
• 3.1.5 3'端加A25
• 3.1.6 使用Axygen PCR清潔試劑盒純化25-26
• 3.1.7 加甲基化接頭26
• 3.1.8 瓊脂糖電泳26-27
• 3.1.9 割膠回收27
• 3.1.10 重亞硫酸氫鹽轉化27-28
• 3.1.11 PCR擴增28
• 3.1.12 磁珠純化28-29
• 3.1.13 上機測序29
• 3.2 數(shù)據分析流程29-32
• 3.2.1 測序質量評估30
• 3.2.2 序列比對30-31
• 3.2.3 胞嘧啶甲基化的統(tǒng)計31-32
• 3.2.4 CpG的注釋32
• 4 結果32-42
• 4.1 質量控制32-34
• 4.2 基本的數(shù)據統(tǒng)計34-35
• 4.3 不同樣品CpG覆蓋度及甲基化分布35-38
• 4.4 兩組樣品CpG在功能元件上的注釋38-39
• 4.5 落在不同重復序列的CpG的甲基化情況39-40
• 4.6 差異甲基化區(qū)域(DMR)分析40-42
• 5 小結42-43
• 第三章 RRBS深入分析流程的建立及其在不同腫瘤細胞中等位基因特異甲基化分析的應用43-68
• 1 引言43-44
• 2 實驗材料44
• 3 實驗和數(shù)據分析方法44-46
• 3.1 RRBS文庫構建44
• 3.2 數(shù)據分析方法44-46
• 3.2.1 RRBS數(shù)據的ASM分析45-46
• 3.2.2 RRBS數(shù)據的SNP分析46
• 3.2.3 SNP與ASM的連鎖分析46
• 3.2.4 ASM與基因表達的相關性分析46
• 4 結果46-67
• 4.1 知印記基因ASM與X染色體失活分析46-51
• 4.2 SNP分析驗證分析ASM方法的可靠度51-54
• 4.3 腫瘤細胞系中ASM存在較大差異54-56
• 4.4 細胞中ASM的維持與UHRF1有關56-62
• 4.5 細胞中ASM的產生與DNMT3A有關62-66
• 4.6 細胞中ASM與基因表達無關66-67
• 5 小結67-68
• 第四章 總結與討論68-71
• 攻讀學位期間待發(fā)表論文71-72
• 參考文獻72-78
• 附錄1 代碼78-90
• 1 CpG在不同特征區(qū)域上的注釋78-79
• 2 CpG在重復序列上的注釋79-81
• 3 計算每個reads的平均甲基化81-82
• 4 計算每個區(qū)段甲基化標準差82-84
• 5 不同區(qū)段在已知ASM上的注釋84-86
• 6 提取每個reads甲基化表型86-87
• 7 提取目的片段甲基化表型87-88
• 8 ASM在不同特征區(qū)域上的注釋88-90
• 致謝90

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