本文關(guān)鍵詞：RRBS數(shù)據(jù)分析新流程的建立及其在腫瘤細(xì)胞中等位基因特異甲基化分析的應(yīng)用

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【摘要】：DNA甲基化是非常重要的表觀遺傳修飾之一,在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、X染色體失活、基因組印記、腫瘤發(fā)生等方面扮演著重要的角色。DNA甲基化譜式異常是腫瘤的重要特征之一,目前在大部分腫瘤細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了整體的DNA甲基化水平降低和部分區(qū)域的甲基化水平增高,但具體的DNA甲基化異常的分子機(jī)制目前尚不清楚。簡化的有代表性的重亞硫酸鹽測序(RRBS)技術(shù)是近年來發(fā)明的全基因組水平的DNA甲基化分析技術(shù),但是因?yàn)槠鋽?shù)據(jù)分析的復(fù)雜性,現(xiàn)有的分析軟件不能完全滿足研究的需要。起始性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A在腫瘤細(xì)胞DNA甲基化譜式異常中的作用并不清楚,我們利用RRBS技術(shù)檢測了在肺癌細(xì)胞A549中過表達(dá)DNMT3A之后基因組DNA甲基化的譜式變化。通過完善數(shù)據(jù)分析流程后,我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)DNMT3A之后,基因組DNA整體甲基化上升了9.1%,并且這種上升在不同基因特征區(qū)域間沒有顯著差異。另外,起始性的DNA甲基化變化比例并不高,更多的是已有甲基化水平的少量上升,而且重復(fù)序列的甲基化水平也呈現(xiàn)與整體相當(dāng)?shù)纳仙＿M(jìn)一步區(qū)域分析發(fā)現(xiàn),過表達(dá)DNMT3A導(dǎo)致一些基因啟動(dòng)子區(qū)起始性的高甲基化,包括了RFPL3、 TFAP2E等,可能參與抑制腫瘤細(xì)胞的生長。以上結(jié)果顯示DNMT3A在腫瘤細(xì)胞中參與DNA甲基化水平維持,并能調(diào)控一些腫瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。接下來,我們開發(fā)了單個(gè)分子連續(xù)CpG甲基化連鎖分析方法,并加入了DNA甲基化與單核苷酸多態(tài)性連鎖分析以及DNA甲基化與基因表達(dá)相關(guān)性分析。利用這些分析手段,我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞系中普遍存在等位基因特異的DNA甲基化(ASM)。為了明確這些ASM的具體特征,我們?cè)诙喾N腫瘤細(xì)胞系中進(jìn)行了RRBS檢測和數(shù)據(jù)分析,同時(shí)比較了3個(gè)公開的人類胎盤RRBS數(shù)據(jù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些ASM除了已知的印記基因和X染色體失活相關(guān)的區(qū)域外,存在著大量的功能未知的基因組區(qū)域。但是,與胎盤中的結(jié)果不同,不同腫瘤細(xì)胞中的這些ASM沒有共同性,提示其可能只是腫瘤DNA甲基化譜式紊亂的一種表現(xiàn)。為了進(jìn)一步分析ASM產(chǎn)生和維持的分子機(jī)制,我們?cè)谀[瘤細(xì)胞系中改變維持性或起始性的DNA甲基化系統(tǒng),包括過表達(dá)UHRF1、抑制表達(dá)UHRF1和過表達(dá)DNMT3A,并引入了DNMT3A基因與組蛋白互作結(jié)構(gòu)域的突變體。通過RRBS檢測結(jié)合數(shù)據(jù)分析流程,我們發(fā)現(xiàn)UHRF1對(duì)于ASM的維持是必須的,而新ASM的產(chǎn)生則需要DNMT3A介導(dǎo),這種介導(dǎo)與DNMT3A結(jié)合組蛋白未修飾H3K4有關(guān)。當(dāng)DNMT3A突變體結(jié)合甲基化的H3K4或者不結(jié)合H3K4時(shí),產(chǎn)生的新ASM顯著增多,推測是導(dǎo)致了起始性的DNA甲基化所致。最后,我們結(jié)合了腫瘤細(xì)胞RNAseq的基因表達(dá)數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中的這些ASM與基因表達(dá)無明顯的相關(guān)性。綜合以上結(jié)果,腫瘤細(xì)胞中新發(fā)現(xiàn)的ASM與DNA甲基化維持和起始系統(tǒng)相關(guān),但是不具有明確的調(diào)控基因表達(dá)功能,各種腫瘤細(xì)胞特異性極大,可能是腫瘤細(xì)胞DNA甲基化譜式紊亂的一種新的特征,是DNA甲基化化酶功能不足的一種表現(xiàn),進(jìn)一步的分子機(jī)制可以結(jié)合臨床腫瘤樣本開展。綜上所述,本研究開發(fā)并完善了RRBS檢測的數(shù)據(jù)分析流程,發(fā)現(xiàn)DNMT3A在腫瘤細(xì)胞中參與DNA甲基化譜式異常調(diào)控的證據(jù)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞系中大量新的ASM,并對(duì)他們的特征與功能進(jìn)行了初步分析。本研究建立的分析流程可以應(yīng)用到更多的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制研究中去,本研究的結(jié)果可以為進(jìn)一步闡明腫瘤細(xì)胞中DNA甲基化譜式紊亂的分子機(jī)制提供幫助。
【關(guān)鍵詞】：RRBS 腫瘤 DNA甲基化 DNMT3A UHRF1 ASM
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-22
• 1 DNA甲基化研究進(jìn)展14-16
• 1.1 DNA甲基化14-15
• 1.2 DNA甲基化酶15
• 1.3 DNA去甲基化15-16
• 2 DNA甲基化檢測方法16-18
• 2.1 高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)17
• 2.2 免疫共沉淀法17
• 2.3 基于重亞硫酸鹽處理法17-18
• 3 DNA甲基化數(shù)據(jù)分析18-21
• 3.1 DNA甲基化數(shù)據(jù)比對(duì)18-19
• 3.2 差異甲基化分析及可視化19-21
• 4 研究目的與意義21-22
• 第二章 RRBS傳統(tǒng)分析流程的建立及其在A549過表達(dá)DNMT3A的RRBS數(shù)據(jù)分析中的應(yīng)用22-43
• 1 引言22-23
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料23-24
• 2.1 細(xì)胞株23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑或試劑盒23-24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)儀器24
• 3 實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析方法24-32
• 3.1 RRBS文庫的構(gòu)建24-29
• 3.1.1 細(xì)胞基因組DNA的提取24
• 3.1.2 MSPI酶切反應(yīng)24
• 3.1.3 使用Axygen PCR清潔試劑盒純化24-25
• 3.1.4 末端修復(fù)25
• 3.1.5 3'端加A25
• 3.1.6 使用Axygen PCR清潔試劑盒純化25-26
• 3.1.7 加甲基化接頭26
• 3.1.8 瓊脂糖電泳26-27
• 3.1.9 割膠回收27
• 3.1.10 重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化27-28
• 3.1.11 PCR擴(kuò)增28
• 3.1.12 磁珠純化28-29
• 3.1.13 上機(jī)測序29
• 3.2 數(shù)據(jù)分析流程29-32
• 3.2.1 測序質(zhì)量評(píng)估30
• 3.2.2 序列比對(duì)30-31
• 3.2.3 胞嘧啶甲基化的統(tǒng)計(jì)31-32
• 3.2.4 CpG的注釋32
• 4 結(jié)果32-42
• 4.1 質(zhì)量控制32-34
• 4.2 基本的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)34-35
• 4.3 不同樣品CpG覆蓋度及甲基化分布35-38
• 4.4 兩組樣品CpG在功能元件上的注釋38-39
• 4.5 落在不同重復(fù)序列的CpG的甲基化情況39-40
• 4.6 差異甲基化區(qū)域(DMR)分析40-42
• 5 小結(jié)42-43
• 第三章 RRBS深入分析流程的建立及其在不同腫瘤細(xì)胞中等位基因特異甲基化分析的應(yīng)用43-68
• 1 引言43-44
• 2 實(shí)驗(yàn)材料44
• 3 實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析方法44-46
• 3.1 RRBS文庫構(gòu)建44
• 3.2 數(shù)據(jù)分析方法44-46
• 3.2.1 RRBS數(shù)據(jù)的ASM分析45-46
• 3.2.2 RRBS數(shù)據(jù)的SNP分析46
• 3.2.3 SNP與ASM的連鎖分析46
• 3.2.4 ASM與基因表達(dá)的相關(guān)性分析46
• 4 結(jié)果46-67
• 4.1 知印記基因ASM與X染色體失活分析46-51
• 4.2 SNP分析驗(yàn)證分析ASM方法的可靠度51-54
• 4.3 腫瘤細(xì)胞系中ASM存在較大差異54-56
• 4.4 細(xì)胞中ASM的維持與UHRF1有關(guān)56-62
• 4.5 細(xì)胞中ASM的產(chǎn)生與DNMT3A有關(guān)62-66
• 4.6 細(xì)胞中ASM與基因表達(dá)無關(guān)66-67
• 5 小結(jié)67-68
• 第四章 總結(jié)與討論68-71
• 攻讀學(xué)位期間待發(fā)表論文71-72
• 參考文獻(xiàn)72-78
• 附錄1 代碼78-90
• 1 CpG在不同特征區(qū)域上的注釋78-79
• 2 CpG在重復(fù)序列上的注釋79-81
• 3 計(jì)算每個(gè)reads的平均甲基化81-82
• 4 計(jì)算每個(gè)區(qū)段甲基化標(biāo)準(zhǔn)差82-84
• 5 不同區(qū)段在已知ASM上的注釋84-86
• 6 提取每個(gè)reads甲基化表型86-87
• 7 提取目的片段甲基化表型87-88
• 8 ASM在不同特征區(qū)域上的注釋88-90
• 致謝90

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