本文關(guān)鍵詞：永生化食管上皮惡變細胞中核干細胞因子對細胞增殖的影響

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【摘要】：背景中國的食管癌發(fā)病率和死亡率均遠高于世界平均水平,細胞增殖異常與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。核干細胞因子(nucleostemin,NS)是一個重要的細胞增殖調(diào)節(jié)因子,可維持干細胞和癌細胞的增殖,并保持細胞不分化。本項目在前期研究的基礎(chǔ)上,將采用永生化食管上皮細胞系(SHEE)及其惡變細胞系(SHEEC),測定SHEE及SHEEC中NS、細胞周期蛋白B1(Cyclin B1)和抑癌基因PTEN的m RNA和蛋白的表達變化,用RNA干擾技術(shù)降低NS表達,觀察對細胞惡性變的影響。本項目對揭示NS在SHEEC食管癌細胞中對細胞增殖的影響具有重要意義。目的觀察永生化食管上皮惡變細胞中核干細胞因子對細胞增殖的影響方法1.SHEE和SHEEC細胞傳代培養(yǎng),應(yīng)用RT-PCR及Western Blot方法分別檢測SHEE和SHEEC細胞中NS、細胞周期蛋白B1(cyclin B1)及人第10號染色體缺失的磷酸酶(PTEN)的表達。2.設(shè)計并合成NS si RNA,轉(zhuǎn)染SHEEC細胞,實驗分為3組,分別為試劑對照組(Mock)、陰性對照組(NC)及轉(zhuǎn)染組(NS-1543),應(yīng)用RT-PCR及Western Blot方法分別檢測各組NS、cyclin B1及PTEN的表達變化。3.應(yīng)用MTT法檢測各組細胞增殖活性,PI染色和Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞周期和凋亡變化。4.統(tǒng)計學(xué)處理均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件,統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,兩組均數(shù)比較用t檢驗;多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析,多組均數(shù)間的兩兩比較采用LSD方法,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果1.SHEEC細胞中NS、Cyclin B1及PTEN m RNA相對于SHEE的表達量分別為2.047±0.507、2.214±0.213及0.668±0.188,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.SHEE及SHEEC中NS、Cyclin B1及PTEN蛋白表達量分別為(1.142±0.113,3.161±0.108)、(1.585±0.056,2.173±0.058)、(1.894±0.341,1.162±0.524),均為P0.05。3.沉默SHEEC中NS表達后,Mock組、NC組和NS-1543組Cyclin B1、PTEN m RNA和蛋白相對表達量分別為(1.057±0.054,0.998±0.104,0.621±0.133)、(1.069±0.059,0.999±0.085,2.319±0.148)和(1.913±0.177,1.735±0.275,0.597±0.103)、(0.791±0.382,0.880±0.077,2.409±0.058),均為P0.05。4.下調(diào)SHEEC中NS表達量后,Mock組、NC、NS-1543組細胞凋亡率分別為7.233±0.427、9.318±0.703、33.667±2.517,P0.05。細胞周期G0/G1期細胞百分比增加,S期和G2/M期細胞百分比降低,P0.05。5.下調(diào)SHEEC中NS表達,轉(zhuǎn)染24h、36h及48h的NS-1543組細胞增殖活性分別較Mock組和NC組降低,P0.05,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論1.沉默NS表達可阻滯細胞周期于G0/G1期,抑制SHEEC細胞的增殖,促進細胞凋亡,且伴隨Cyclin B1表達的降低和PTEN表達的增加。2.NS可以促進SHEEC細胞的增殖。
【關(guān)鍵詞】：永生化食管上皮細胞 永生化食管上皮惡變細胞 核干細胞因子 細胞周期蛋白B1 人第10號染色體缺失的磷酸酶 細胞增殖
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 中英文縮略詞表13-15
• 1 前言15-18
• 2 材料與方法18-36
• 2.1 材料18-22
• 2.1.1 細胞來源18
• 2.1.2 實驗試劑18-19
• 2.1.3 主要儀器19-20
• 2.1.4 主要試劑配置20-22
• 2.2 方法22-36
• 2.2.1 方法流程圖22-23
• 2.2.2 細胞培養(yǎng)23-24
• 2.2.3 RT-PCR檢測永生化食管上皮細胞系SHEE及其惡變細胞系SHEEC中核干細胞因子NS、Cyclin B1、PTEN m RNA的表達24-28
• 2.2.4 Western blot檢測各組中目的基因的蛋白表達情況28-31
• 2.2.5 細胞轉(zhuǎn)染31-34
• 2.2.6 PI染色檢測細胞周期34
• 2.2.7 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測NS沉默前后對SHEEC細胞凋亡率的影響 .34-35
• 2.2.8 MTT法檢測NS沉默前后細胞增殖活性35
• 2.2.9 統(tǒng)計分析35-36
• 3 結(jié)果36-50
• 3.1 RT-PCR檢測SHEE、SHEEC中NS、Cyclin B1及PTEN的m RNA表達變化36-40
• 3.1.1 RNA純度和完整性檢測結(jié)果36
• 3.1.2 Real-Time PCR結(jié)果36-40
• 3.2 Western blot檢測SHEE、SHEEC中NS、Cyclin B1及PTEN的蛋白表達變化40-42
• 3.2.1 BCA蛋白濃度測定40-41
• 3.2.2 SHEE及SHEEC中NS、Cyclin B1、PTEN蛋白表達水平41-42
• 3.3 NS基因抑制結(jié)果42-50
• 3.3.1 SHEEC細胞的轉(zhuǎn)染條件42-43
• 3.3.2 最佳干擾鏈的篩選43-44
• 3.3.3 抑制SHEEC細胞NS表達對增殖相關(guān)指標(biāo)Cyclin B1和PTEN m RNA的影響44-45
• 3.3.4 SHEEC細胞NS低表達對NS、Cyclin B1和PTEN蛋白的影響45-46
• 3.3.5 細胞凋亡率檢測46-47
• 3.3.6 抑制NS表達對細胞周期的影響47-48
• 3.3.7 MTT法檢測抑制SHEEC中NC表達對細胞增殖的影響48-50
• 4 討論50-56
• 4.1 NS、Cyclin B1及PTEN在SHEE、SHEEC及基因沉默SHEEC細胞中的表達50-52
• 4.1.1 NS在SHEEC細胞中高表達50-51
• 4.1.2 Cyclin B1在SHEEC細胞中高表達51
• 4.1.3 PTEN在SHEEC細胞中低表達51-52
• 4.2 設(shè)計合成針對NS的si RNA及其干擾效果52-53
• 4.3 NS（核干細胞因子）是細胞增殖調(diào)節(jié)因子53-54
• 4.4 NS表達下調(diào)對細胞凋亡及周期的影響54-55
• 4.5 NS si RNA干擾的臨床應(yīng)用前景55-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻57-62
• 綜述62-74
• 參考文獻70-74
• 個人簡歷74-75
• 致謝75

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