本文關(guān)鍵詞：小鼠肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法構(gòu)建與HBx通過(guò)調(diào)控PDK1磷酸化參與HCC發(fā)生

  更多相關(guān)文章： 磷酸化 蛋白質(zhì)組學(xué) 肝臟 HBx 肝細(xì)胞癌 PDK1

【摘要】：磷酸化修飾是一種重要的翻譯后修飾方式,調(diào)節(jié)著細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、肌肉收縮、新陳代謝等生物學(xué)過(guò)程,但由于蛋白質(zhì)磷酸化在細(xì)胞內(nèi)的低化學(xué)計(jì)量、不均一性以及實(shí)驗(yàn)技術(shù)的限制,許多磷酸化現(xiàn)象還未得以發(fā)現(xiàn)。近年由于質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展,結(jié)合磷酸化肽段富集技術(shù)使得對(duì)磷酸化進(jìn)行大規(guī)模鑒定成為可能,結(jié)合生物信息分析,可以獲得全面的磷酸化蛋白質(zhì)組的信息,為細(xì)胞基本生命活動(dòng)分子機(jī)制、疾病發(fā)生機(jī)制及和藥物靶點(diǎn)等多方面研究提供一個(gè)有力的平臺(tái)。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)是一種高通量蛋白分離和質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合的磷酸化蛋白鑒定的學(xué)科,通過(guò)對(duì)于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的分析,來(lái)發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的分子標(biāo)志物、診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)、數(shù)目及其動(dòng)態(tài)變化的鑒定具有十分重要的意義。磷酸化修飾起到廣泛的調(diào)節(jié)作用,很多疾病的發(fā)生都是由磷酸化修飾的異常而導(dǎo)致的,蛋白質(zhì)的磷酸化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是由蛋白激酶、磷酸結(jié)合蛋白、磷酸酶三個(gè)部分組成。蛋白激酶是其中重要的調(diào)節(jié)因子,很多疾病的發(fā)生與磷酸化修飾的失調(diào)和磷酸化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的紊亂有關(guān)[2],蛋白激酶中每一個(gè)磷酸化位點(diǎn)的修飾都具有重要的生物學(xué)意義,磷酸化修飾通過(guò)改變蛋白的構(gòu)象改變和蛋白與蛋白之間的相互作用而起到功能調(diào)節(jié)的作用。HBV是雙鏈環(huán)狀DNA病毒,由編碼外殼蛋白的S區(qū)、編碼核心蛋白的C區(qū)、編碼聚合酶的P區(qū)以及X區(qū)四部分組成。HBx是HBV開(kāi)放閱讀塊X區(qū)編碼的的蛋白,蛋白質(zhì)分子量為17k D,由154個(gè)氨基酸組成,HBx是在哺乳動(dòng)物中高度保守的區(qū)域。肝細(xì)胞癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,占癌癥死亡率第二位,嚴(yán)重威脅著人們的健康。在我國(guó)80%肝細(xì)胞癌的發(fā)生與HBV的感染相關(guān),HBx保守的存在于病毒DNA中,而且有一些研究認(rèn)為在沒(méi)有HBV復(fù)制的情況下,HBx仍表達(dá)于肝細(xì)胞癌細(xì)胞中[3]。HBx廣泛的參與細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程,起到轉(zhuǎn)錄激活作用、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)調(diào)節(jié)的作用,在HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,起到促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的作用,因此HBx被認(rèn)為是與HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)蛋白。文章的第一章我們構(gòu)建了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,對(duì)正常小鼠的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了收集和分析,并對(duì)該方法進(jìn)行了評(píng)估。我們對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行FASP酶切,再利用Ti O2對(duì)于酶切后的肽段進(jìn)行富集,我們對(duì)酶切后的肽段進(jìn)行分離,以提高Ti O2富集磷酸化肽時(shí)的效率,最后對(duì)富集后的磷酸化肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析。利用該方法,我們鑒定到了1271個(gè)磷酸化蛋白、5386磷酸化位點(diǎn)和4553磷酸化肽段,并對(duì)鑒定到的磷酸化修飾蛋白進(jìn)行GO分析、Motif分析、激酶分類、新鑒定到的激酶磷酸化位點(diǎn)的分析。蛋白激酶抑制劑在癌癥治療時(shí)也是主要和高效的藥物,文章中對(duì)于新的激酶位點(diǎn)的挖掘,可以為蛋白激酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)提供有價(jià)值的信息,也為探討和研究磷酸化修飾蛋白在肝臟生理病理過(guò)程中發(fā)揮的重要作用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在文章的第二章中,我們首次對(duì)HBx轉(zhuǎn)基因肝癌小鼠肝臟和正常小鼠肝臟進(jìn)行大規(guī)模高通量的差異磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析,并且得到了差異的磷酸化蛋白的數(shù)據(jù),并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了進(jìn)一步的挖掘和分析。在我們的研究中,利用HBx基因定點(diǎn)插入的小鼠模型,并且生長(zhǎng)到24個(gè)月的時(shí)候HBx基因型的小鼠形成了肝細(xì)胞癌,通過(guò)病理切片和RT-PCR的檢測(cè),我們確認(rèn)小鼠模型構(gòu)建成功。利用該模型,我們對(duì)24月齡的HBx基因型小鼠和野生型小鼠進(jìn)行了基于SILAC的磷酸化蛋白質(zhì)組差異分析。利用HBx基因定點(diǎn)插入的24月齡小鼠肝癌模型和24月齡野生型小鼠模型的差異磷酸化蛋白質(zhì)組的比較,我們發(fā)現(xiàn)了功能重要的PDK1和WNK1兩個(gè)激酶。在我們鑒定到數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)在HBx組PDK1和WNK1的磷酸化水平發(fā)生明顯的上調(diào),所以我們重點(diǎn)關(guān)注了這兩個(gè)激酶與HBx的關(guān)系,并且構(gòu)建了HBx瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株來(lái)進(jìn)一步闡述HBx對(duì)于PDK1的調(diào)控,發(fā)現(xiàn)在HBx過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系中,p-PDK1發(fā)生明顯的上調(diào),同時(shí)p-WNK1的磷酸化也發(fā)生明顯的上調(diào)。根據(jù)目前已有的研究,我們知道PDK1參與調(diào)控細(xì)胞增殖,當(dāng)我們用PI3K和PDK1的激酶抑制劑處理細(xì)胞時(shí),細(xì)胞增殖會(huì)被有效抑制,然而在穩(wěn)定表達(dá)HBx的細(xì)胞中,PI3K和PDK1的抑制劑的效果會(huì)減弱,并且p-PDK1和p-WNK1會(huì)有劑量依賴性的下調(diào),所以可以得出結(jié)論,HBx能夠有效抑制PI3K和PDK1抑制劑的抑制增殖的作用,并且很有可能是通過(guò)PDK1/WNK1這條通路來(lái)發(fā)揮抑制增殖作用的。在HBV相關(guān)的HCC的臨床樣本中,我們對(duì)我們的假設(shè)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)在HBV陽(yáng)性的HCC中,相比于癌旁組織p-PDK1發(fā)生了顯著的上調(diào)。我們利用差異磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)肝癌小鼠和正常小鼠進(jìn)行了組學(xué)分析,并對(duì)得到的差異蛋白進(jìn)行了深度的挖掘,對(duì)于得到的差異蛋白進(jìn)行了調(diào)研,并提出了相關(guān)的假設(shè),并且驗(yàn)證了HBx對(duì)于PDK1的調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：磷酸化 蛋白質(zhì)組學(xué) 肝臟 HBx 肝細(xì)胞癌 PDK1
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 英文縮寫詞對(duì)照表5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-19
• 第一章小鼠肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組方法構(gòu)建19-34
• 1.1 材料與方法19-20
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器19-20
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法20-22
• 1.2.1 C57BL/6J小鼠肝臟蛋白質(zhì)提取20
• 1.2.2 小鼠肝臟蛋白酶切20-21
• 1.2.3 TiO2富集磷酸化肽段21
• 1.2.4 HPLC分離磷酸化肽段21
• 1.2.5 磷酸化肽段質(zhì)譜鑒定21-22
• 1.2.6 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索22
• 1.3 結(jié)果與討論22-32
• 1.3.1 正常小鼠肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集22-25
• 1.3.2 激酶磷酸化位點(diǎn)分析25-30
• 1.3.3 模序富集分析30-32
• 1.4 小結(jié)32-34
• 第二章HBx通過(guò)調(diào)控PDK1 磷酸化參與HCC發(fā)生34-46
• 2.1 材料與方法34-35
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和材料34-35
• 2.1.2 儀器設(shè)備35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法35-40
• 2.2.1 RT-PCR檢測(cè)24月齡小鼠模型HBx表達(dá)35-38
• 2.2.2 小鼠肝臟組織樣品制備38
• 2.2.3 HBx組和WT組小鼠肝臟蛋白酶切、富集、分離（方法同第一章）38
• 2.2.4 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和數(shù)據(jù)質(zhì)控38-39
• 2.2.5 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)Western Bloting39
• 2.2.6 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖39
• 2.2.7 免疫共沉淀Co-IP39-40
• 2.2.8 數(shù)據(jù)分析40
• 2.3 結(jié)果40-46
• 2.3.1 小鼠模型評(píng)價(jià)40
• 2.3.2 定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)產(chǎn)出40
• 2.3.3 重要磷酸化蛋白的篩選40-41
• 2.3.4 HBx過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)PDK1 磷酸化水平上調(diào)41-42
• 2.3.5 HBx減弱PI3K和PDK1 抑制劑的作用42-43
• 2.3.6 HBx減弱了PI3K和PDK1 抑制劑的抑制增殖作用43-45
• 2.3.7 P-PDK1 在HCC臨床樣本中的驗(yàn)證45-46
• 2.4 小結(jié)46
• 總結(jié)46-48
• 文獻(xiàn)綜述48-54
• 參考文獻(xiàn)54-63
• 附錄63-103
• 致謝103

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 陳俊意;黃愛(ài)龍;徐莉;陳典全;余虹;朱照靜;黃祖春;楊宗發(fā);陳立書;譚濤;;HBV亞基因型B和C體外重組中間體的檢測(cè)(英文)[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年02期

2 ;Three-dimensional structure of the hepatitis B core antigen particle truncated at residue 154[J];Science China(Life Sciences);2011年02期

3 劉樹(shù)郁;何鍵;李鯤鵬;戴阿光;蔡常潔;張景強(qiáng);;乙型肝炎核心抗原C端154截短顆粒的三維結(jié)構(gòu)[J];中國(guó)科學(xué):生命科學(xué);2010年03期

4 姚全良;劉金輝;劉寧;;乙型肝炎病毒增強(qiáng)子Ⅰ區(qū)核苷酸序列變異分析[J];江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2009年12期

5 QIN Bo;PEI RongJuan;HE TingTing;HUANG ZhaoHui;PAN GuoShao;TU ChunYu;LU MengJi;CHEN XinWen;;Polymerase mutations rtN238R,rtT240Y and rtN248H of hepatitis B virus decrease susceptibility to adefovir[J];Chinese Science Bulletin;2013年15期

6 吳東波;劉范偉;唐紅;趙連三;晏菊芳;陳守春;周陶友;;腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體對(duì)乙型肝炎病毒啟動(dòng)子的調(diào)控作用[J];華西醫(yī)學(xué);2012年11期

7 余克花;周艷;劉金輝;姚全良;;慢性乙型肝炎患者血清HBV增強(qiáng)子Ⅰ區(qū)分子特征分析[J];山東醫(yī)藥;2011年35期

8 謝素蘭;黃愛(ài)龍;蔡雪飛;胡源;;含阿德福韋酯耐藥突變位點(diǎn)的HBV聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域的原核表達(dá)[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2011年08期

9 潘萬(wàn)龍;方巖;許舸;羅強(qiáng);黃媛;陶穎;黃愛(ài)龍;胡接力;;HBsAg缺失型乙型肝炎病毒復(fù)制細(xì)胞模型的建立及其對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的影響[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2013年08期

10 潘家超;張樂(lè);徐琳琳;單曉宇;杜文軍;陳士俊;;黑素瘤缺乏因子2誘導(dǎo)的固有免疫在慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年04期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張p，

本文編號(hào)：709644