本文關(guān)鍵詞：SIRT1在胃癌組織中的表達(dá)及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： SIRT1 胃癌 Cyclin D1 真核表達(dá)載體 重組質(zhì)粒

【摘要】：目的：檢測(cè)101例胃癌組織中SIRT1、β-catenin的表達(dá)水平并探討其與胃癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。通過(guò)克隆SIRT1基因的全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建含有SIRT1及其突變體T200I和E420K基因的重組真核表達(dá)載體,從而進(jìn)一步研究在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中SIRT1及其突變體所發(fā)揮的生物學(xué)功能。方法：收集101例濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)切除的胃癌組織,制作石蠟標(biāo)本,通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)SIRT1、β-catenin的表達(dá)并分析其與腫瘤臨床病理特征的相關(guān)性。RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法擴(kuò)增SIRT1基因的全長(zhǎng)cDNA,其擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)雙酶切被克隆至pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體中,從而使SIRT1基因表達(dá)增加。同時(shí)采用定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建SIRT1基因的突變體T200I和E420K,進(jìn)而獲得其真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-T200I和pcDNA3.1(+)-E420K。重組質(zhì)粒通過(guò)酶切和DNA測(cè)序比對(duì)得以鑒定,同時(shí)采用Western blotting實(shí)驗(yàn)從蛋白水平上證實(shí)重組真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。制備感受態(tài)細(xì)胞、做質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并通過(guò)質(zhì)粒抽提獲取足量的pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-SIRT1、pcDNA3.1(+)-T200I、pcDNA3.1(+)-E420K真核表達(dá)載體,然后將其通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,分別采用MTT、流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)無(wú)DNA轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照(空白組)、空載體pcDNA3.1(+)(空載組)、重組載體pcDNA3.1(+)- STRT1(WT組)、pcDNA3.1(+)-T200I(T200I組)、pcDNA3.1(+)-E420K (E420K組)五組細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期改變情況,并且采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)五組細(xì)胞中Cyclin D1的表達(dá)。SIRT1抑制劑NAM處理293T細(xì)胞后檢測(cè)其細(xì)胞體外增殖能力以及Cyclin D1的表達(dá)情況。結(jié)果：胃癌組織中SIRT1、β-catenin基因在的陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.4%(65/101)和47.5%(48/101),并且SIRT1在不同胃癌組織學(xué)分型中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); SIRT1的高表達(dá)與胃癌腫瘤大小、發(fā)生部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及β-catenin的表達(dá)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),SIRT1表達(dá)與β-catenin的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.01；P=0.751)。通過(guò)獲得并擴(kuò)增SIRT1基因的全長(zhǎng)cDNA,構(gòu)建了SIRT1基因的pcDNA3.1(+)-SIRT1重組質(zhì)粒及其突變體基因的pcDNA3.1(+)-T200I和pcDNA3.1(+)-E420K真核表達(dá)載體。將其使用酶切以及DNA測(cè)序比對(duì)測(cè)定后證實(shí)陽(yáng)性重組質(zhì)粒與預(yù)期序列完全相符。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,MTT實(shí)驗(yàn)顯示重組載體pcDNA3.1(+)-STRT1(WT組)、pcDNA3.1(+)-T200I(T200I組)、pcDNA3.1(+)-E420K (E420K組)的細(xì)胞增殖能力高于無(wú)DNA轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照(空白組)和空載體pcDNA3.1(+)(空載組)(P0.05),而WT組、T200I組和E420K組三組之間的細(xì)胞增殖能力無(wú)顯著差異(P0.05)。SIRT1抑制劑NAM處理293T細(xì)胞后其細(xì)胞體外增殖能力降低。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期,結(jié)果顯示W(wǎng)T組、T200I組和E420K組三組細(xì)胞的生長(zhǎng)分?jǐn)?shù)(S期+G2期細(xì)胞所占比例)高于空白組和空載組細(xì)胞(P0.05),但該三組細(xì)胞之間細(xì)胞周期改變不顯著(P0.05)。Western blotting實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了WT組、T200I組和E420K組三組細(xì)胞的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1高表達(dá),而采用SIRT1抑制劑處理后細(xì)胞中Cyclin D1低表達(dá)。結(jié)論：本研究證實(shí)SIRT1在腸型胃癌中的表達(dá)明顯高于彌漫性胃癌,由此說(shuō)明SIRT1在不同組織學(xué)類(lèi)型的胃癌中可能發(fā)揮的作用不同。我們成功構(gòu)建了SIRT1及其突變體基因pcDNA3.1(+)-SIRT1、pcDNA3.1(+)- T200I和pcDNA3.1(+)-E420K的真核表達(dá)載體,提供了足夠的SIRT1及其突變體基因的研究材料,有利于進(jìn)行SIRT1的生物學(xué)功能研究。上調(diào)SIRT1及其突變體基因能夠促進(jìn)促進(jìn)細(xì)胞的體外增殖能力和細(xì)胞周期的進(jìn)展,下調(diào)SIRT1基因的表達(dá)抑制細(xì)胞的體外增殖能力和細(xì)胞周期的進(jìn)展,其機(jī)制可能與改變了CyclinD1的表達(dá)相關(guān)。而SIRT1基因的突變體T200I和E420K對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期沒(méi)有影響。本研究顯示SIRT1在胃癌的發(fā)生發(fā)展中有可能發(fā)揮促癌基因的作用,這提示我們SIRT1的抑制劑有可能具有臨床應(yīng)用的潛在價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：SIRT1 胃癌 Cyclin D1 真核表達(dá)載體 重組質(zhì)粒
【學(xué)位授予單位】：濱州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 縮略詞表10-12
• 前言12-14
• 第一部分 SIRT1在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義14-27
• 1. 材料與方法14-19
• 2. 結(jié)果19-21
• 3. 討論21-24
• 參考文獻(xiàn)24-27
• 第二部分 SIRT1及其突變體T200I、E420K真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定27-40
• 1. 材料和方法27-33
• 2. 結(jié)果33-35
• 3. 討論35-38
• 參考文獻(xiàn)38-40
• 第三部分 SIRT1基因及其突變體對(duì)293T細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響40-56
• 1. 材料與方法40-47
• 2. 結(jié)果47-51
• 3. 討論51-54
• 參考文獻(xiàn)54-56
• 全文總結(jié)56-57
• 文獻(xiàn)綜述 Sirtl與腫瘤耐藥的研究進(jìn)展57-66
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 致謝66-67
• 碩士期間發(fā)表論文情況67

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