本文關(guān)鍵詞：甲硫噠嗪對人結(jié)腸癌干細(xì)胞的作用研究

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【摘要】：腫瘤干細(xì)胞是腫瘤中數(shù)量較少但生命力很強(qiáng)的細(xì)胞，它抵抗化療和放療，不易被定位,還可分化成新的腫瘤細(xì)胞,導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)。因此，殺傷腫瘤干細(xì)胞已成為癌癥治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)。 結(jié)腸癌在西方國家占腫瘤死亡率的第二位，我國結(jié)腸癌發(fā)病人數(shù)也呈逐年上升趨勢。結(jié)腸癌的病變位置隱蔽，早期癥狀不明顯，容易被患者忽略，且預(yù)后多復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后多產(chǎn)生耐藥。因此，尋找有效的治療方法十分重要。腫瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為結(jié)腸癌的治療開辟了新的道路。 甲硫噠嗪是一種吩噻嗪類藥物，最早以抗精神分裂作用為人熟知，近年來文獻(xiàn)報(bào)道，其亦可作為抗腫瘤藥物，作為多巴胺受體拮抗劑，抑制D2家族DR受體，阻斷DR信號通路，產(chǎn)生抗血癌腫瘤干細(xì)胞的作用，具有安全性高，毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。 另有文獻(xiàn)報(bào)道，甲硫噠嗪通過靶向抑制血癌干細(xì)胞、胃癌干細(xì)胞及乳腺癌干細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡，發(fā)揮抗腫瘤的作用，但對于結(jié)腸癌干細(xì)胞的研究甚少。 本研究利用免疫磁珠法從結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞HCT116中篩選出表面標(biāo)記為EpCAM+CD44+的結(jié)腸癌干細(xì)胞，并通過誘導(dǎo)分化、單細(xì)胞克隆、細(xì)胞免疫化學(xué)以及干細(xì)胞特異性基因表達(dá)的檢測等方法進(jìn)行鑒定。利用CCK8法檢測甲硫噠嗪對結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖的影響。通過AO/EB熒光雙染法、線粒體膜電位法、Annexin-V-FITC雙染法及流式分析等方法評價(jià)甲硫噠嗪對結(jié)腸癌干細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，篩選所得的EpCAM+CD44+HCT116在無血清培養(yǎng)基中逐漸形成微球，懸浮生長，，經(jīng)含血清培養(yǎng)液誘導(dǎo)后，細(xì)胞微球呈現(xiàn)貼壁生長狀態(tài)。甲硫噠嗪可抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞的增殖，并存在劑量依賴性，在濃度1μmol/L時(shí)，有輕微的促進(jìn)增殖作用。在甲硫噠嗪的作用下，隨著濃度的增加，結(jié)腸癌干細(xì)胞成球能力逐漸下降；AO/EB結(jié)果提示甲硫噠嗪的濃度越高，細(xì)胞凋亡程度越大；Annexin-V-FITC雙染法提示，凋亡早期細(xì)胞比例隨著甲硫噠嗪濃度的增加也隨之增大；JC-1結(jié)果顯示線粒體膜電位降低，并且甲硫噠嗪的濃度越高，凋亡細(xì)胞所占比例越大；Q-PCR檢測結(jié)果提示促凋亡基因Bax表達(dá)上調(diào)，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)下調(diào)；Western Blot結(jié)果提示甲硫噠嗪引起的凋亡是通過Caspase途徑實(shí)現(xiàn)的，且Caspase3的表達(dá)隨著藥物濃度的增加而發(fā)生變化。 綜上所述，甲硫噠嗪可抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)結(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡；本研究為靶向作用腫瘤干細(xì)胞的藥物開發(fā)奠定了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為結(jié)腸癌治療的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：甲硫噠嗪 腫瘤干細(xì)胞 結(jié)腸癌 凋亡
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 中英文對照12-13
• 第1章 緒論13-21
• 1.1 腫瘤干細(xì)胞13
• 1.1.1 腫瘤干細(xì)胞13
• 1.1.2 腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性13
• 1.2 腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒定13-15
• 1.2.1 流式細(xì)胞分選法（FACS）14
• 1.2.2 磁性細(xì)胞分選法（MACS）14
• 1.2.3 側(cè)群細(xì)胞分選法14-15
• 1.2.4 腫瘤干細(xì)胞的鑒定方法15
• 1.3 結(jié)腸癌干細(xì)胞及其標(biāo)記物15-18
• 1.3.1 CD13316
• 1.3.2 CD4416-17
• 1.3.3 EpCAM17
• 1.3.4 Nanog17-18
• 1.3.5 CLDN-618
• 1.4 甲硫噠嗪（Thioridazine）18-20
• 1.4.1 甲硫噠嗪可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖18-19
• 1.4.2 甲硫噠嗪可促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞分化19
• 1.4.3 甲硫噠嗪可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡19-20
• 1.5 實(shí)驗(yàn)立題依據(jù)20-21
• 第2章 材料與試劑21-27
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 儀器21
• 2.1.2 試劑21-23
• 2.1.3 細(xì)胞株23
• 2.1.4 PCR 所用引物23
• 2.2 主要試劑配制23-27
• 2.2.1 PBS 配制23
• 2.2.2 0.25%胰酶-EDTA 混合液配制（10×）23-24
• 2.2.3 RPMI 1640 培養(yǎng)液配制24
• 2.2.4 DMEM/F12 腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)液配制24
• 2.2.5 磁珠分選用 Buffer1 配制24
• 2.2.6 磁珠分選用 Buffer2 配制24-25
• 2.2.7 磁珠分選用 Buffer3 配制25
• 2.2.8 磁珠分選用 Dnase I 配制25
• 2.2.9 藥物溶液的配制25
• 2.2.10 Western Blot 分析用 30%聚丙酰胺溶液配制25
• 2.2.11 Western Blot 分析用 10%SDS 溶液25
• 2.2.12 Western Blot 分析用 10%過硫酸銨（APS）溶液25-26
• 2.2.13 Western Blot 分析用 SDS-PAGE 電泳緩沖液（5×）26
• 2.2.14 Western Blot 分析用轉(zhuǎn)膜液（10×）26
• 2.2.15 Western Blot 分析用 TBS 緩沖液（10×）26
• 2.2.16 5%封閉液26
• 2.2.17 Western Blot 制膠濃度26
• 2.2.18 吖啶橙（AO）26
• 2.2.19 溴化乙錠（EB）26-27
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法27-36
• 3.1 結(jié)腸癌干細(xì)胞的分選、培養(yǎng)及鑒定27-32
• 3.1.1 免疫磁珠法篩選 EpCAM~+CD44~+結(jié)腸癌干細(xì)胞27-28
• 3.1.2 結(jié)腸癌干細(xì)胞培養(yǎng)28-29
• 3.1.3 EpCAM~+CD44~+結(jié)腸癌干細(xì)胞的鑒定29-32
• 3.2 甲硫噠嗪對結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖的影響32-33
• 3.3 甲硫噠嗪對結(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡的影響33-35
• 3.3.1 細(xì)胞形態(tài)觀察33
• 3.3.2 吖啶橙/溴化乙啶（AO/EB）雙染33
• 3.3.3 Annexin V-FITC-PI 雙染色法檢測細(xì)胞早期凋亡33
• 3.3.4 細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測（JC-1）33-34
• 3.3.5 Bax 和 Bcl-2 的 Q-PCR 檢測34
• 3.3.6 Western Blot 檢測 caspase3 蛋白的表達(dá)34-35
• 3.4 數(shù)據(jù)分析35-36
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-43
• 4.1 結(jié)腸癌干細(xì)胞的分選、培養(yǎng)及鑒定36-39
• 4.1.1 EpCAM~+CD44~+HCT116 細(xì)胞的篩選36
• 4.1.2 EpCAM~+CD44~+HCT116 細(xì)胞的培養(yǎng)36
• 4.1.3 EpCAM~+CD44~+HCT116 細(xì)胞的鑒定36-39
• 4.2 甲硫噠嗪對結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖的影響39
• 4.3 甲硫噠嗪對結(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡的影響39-43
• 4.3.1 藥物作用后的細(xì)胞形態(tài)變化39
• 4.3.2 吖啶橙/溴化乙啶（AO/EB）雙染39-40
• 4.3.3 Annexin V-FITC-PI 雙染色法檢測細(xì)胞早期凋亡40-41
• 4.3.4 細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測（JC-1）41
• 4.3.5 Bax 和 Bcl-2 的 Q-PCR 檢測41-42
• 4.3.6 Western Blot 分析42-43
• 第5章 討論43-45
• 第6章 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果49-50
• 致謝50

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Caterina Fanali;Donatella Lucchetti;Marisa Farina;Maddalena Corbi;Valerio Cufino;Achille Cittadini;Alessandro Sgambato;;Cancer stem cells in colorectal cancer from pathogenesis to therapy: Controversies and perspectives[J];World Journal of Gastroenterology;2014年04期

本文編號：702059