本文關(guān)鍵詞：青蒿琥酯對宮頸癌U14細(xì)胞體內(nèi)外生長增殖及移植瘤小鼠外周免疫抑制分子表達(dá)的影響

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【摘要】：目的:目前宮頸癌發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中占第二位,發(fā)病年齡逐年降低,嚴(yán)重危害女性身心健康。宮頸癌的治療模式仍以手術(shù)為主,放化療為輔。但手術(shù)創(chuàng)傷大,放化療不良反應(yīng)明顯,且均可進(jìn)一步損傷機體免疫功能。為此,尋找既能殺傷宮頸癌細(xì)胞又對患者免疫功能無加重?fù)p害的治療方法已成為研究關(guān)注點。青蒿琥酯是一種公認(rèn)的抗瘧類藥物,但研究發(fā)現(xiàn)其對結(jié)直腸癌、肝癌、卵巢癌等均具有明顯的多靶點抗瘤活性。本研究通過體內(nèi)外實驗分析青蒿琥酯(ART)對小鼠宮頸癌U14細(xì)胞生長增殖及移植瘤小鼠免疫功能的影響,從抑制U14細(xì)胞增殖及逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制的角度探討青蒿琥酯的抗宮頸癌作用機制,為其在臨床廣泛應(yīng)用提供相應(yīng)理論支持。方法:1 MTT法分析ART對U14細(xì)胞體外生長增殖的影響:U14細(xì)胞以不同的細(xì)胞濃度(2.5×104/m L、2×105/m L、1.0×106/m L)進(jìn)行培養(yǎng),采用MTT法測定培養(yǎng)不同時間(12h、24h、36h、48h、60h、72h)后細(xì)胞生長增殖的A492值,確定U14細(xì)胞最佳接種濃度及培養(yǎng)時間。以確定的接種濃度及培養(yǎng)時間作為實驗條件,檢測不同濃度(4.69ug/m L-600ug/m L)青蒿琥酯對U14細(xì)胞體外增殖的抑制作用,并計算相對抑制率。2 U14移植瘤小鼠動物模型的建立及實驗分組:以5×107/m L U14細(xì)胞懸液,接種于小鼠左后肢近背部皮下(0.2m L/只)制備小鼠移植瘤模型。成瘤且瘤直徑5mm的小鼠進(jìn)行后續(xù)實驗。將造模成功的移植瘤小鼠隨機分為3組:1、腫瘤對照組;2、ART治療組;3、順鉑(DDP)對照組,每組80只。同時設(shè)立同周齡健康的無移植瘤小鼠作為正常對照組。連續(xù)治療7日后,各組再隨機分為4組,每組20只,分別于第10d、20d、30d、40d處死。3給藥方法:小鼠腫瘤直徑5mm時開始給藥,共治療7d。根據(jù)人體使用劑量換算,ART治療組小鼠肌肉注射ART(20mg/kg/d,0.2m L/次);DDP對照組小鼠腹腔注射順鉑(2mg/kg/d,0.2m L/次);腫瘤對照組及正常對照組小鼠給予等量的0.9%生理鹽水肌注。4小鼠移植瘤生長狀況觀察:從接種腫瘤細(xì)胞之日起每日觀察小鼠一般情況(精神、飲食、體重、活動、毛發(fā)、皮膚等)及移植瘤生長情況。每10d測小鼠體重、移植瘤的最長徑和最短徑,計算腫瘤體積;處死日剝瘤稱取瘤重,計算抑瘤率。觀察各組小鼠存活天數(shù),并計算生命延長率。5 MTT法檢測脾T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化:小鼠處死日無菌取脾稱量脾重,計算脾指數(shù),行小鼠脾T淋巴細(xì)胞ConA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化實驗,計算T淋巴細(xì)胞體外刺激指數(shù)SI。6 ELISA法測定小鼠血清免疫抑制分子表達(dá):小鼠處死日當(dāng)天收集血清,嚴(yán)格按ELISA試劑盒操作,檢測各組小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β1、PGE2含量。結(jié)果:1 U14細(xì)胞培養(yǎng)濃度及培養(yǎng)時間的確定初始培養(yǎng)濃度為2×105/m L時,生長增殖曲線良好而穩(wěn)定,于36h完全覆蓋瓶底,48h后培養(yǎng)液開始變黃,pH值逐漸降低,確定此初始濃度下培養(yǎng)36h為最佳培養(yǎng)條件。2 ART對U14細(xì)胞體外生長增殖的影響與未經(jīng)ART作用的腫瘤細(xì)胞對照組A492值(0.913±0.265)相比,濃度在37.5ug/m L-600ug/m L之間的ART作用后可使U14細(xì)胞生長增殖的A492值呈漸進(jìn)性顯著降低(分別為0.688±0.097、0.678±0.172、0.519±0.086、0.418±0.062、0.063±0.039,均P0.05),相對抑制率呈遞進(jìn)性升高(分別為24.64%、25.74%、43.15%、54.22%、93.10%)。而當(dāng)ART作用濃度≤18.75ug/m L時,A492值與未經(jīng)ART作用的腫瘤細(xì)胞對照組相比無明顯差異。相關(guān)性分析顯示,ART作用濃度與A492值之間呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.971,P=0.000),與相對抑制率之間呈顯著正相關(guān)(r=0.988,P=0.000)。3 ART對小鼠移植瘤生長狀況的影響小鼠皮下接種U14細(xì)胞3-5天后成瘤,成瘤率100%。局部皮膚于接種后10d內(nèi)呈破潰、流膿等明顯的炎癥反應(yīng)。腫瘤對照組小鼠精神萎靡,進(jìn)食量少、睡眠較差,晚期呈消瘦狀態(tài),體重與正常對照組相比顯著下降(均P0.05)。DDP對照組小鼠反應(yīng)差,毛發(fā)晦暗無光澤,食欲差,排便、排尿次數(shù)少,呈消瘦狀態(tài),體重與正常對照組相比顯著下降(均P0.05),且與腫瘤對照組相比10d組體重顯著降低(P0.05),20d、30d、40d組相比均無明顯差異。ART治療組小鼠精神、飲食、睡眠等均較正常對照組小鼠無顯著差異,各時間段小鼠體重較腫瘤對照組及DDP對照組均有顯著回升(均P0.05),與正常對照組小鼠相比20d、40d組體重顯著降低(均P0.05),10d、30d組體重?zé)o明顯改變。各組小鼠體重大致呈現(xiàn)為DDP對照組腫瘤對照組ART治療組正常對照組的總體趨勢。與腫瘤對照組相比,各時間段內(nèi)兩治療組小鼠瘤體積有下降趨勢,DDP對照組小鼠在第10d時瘤體積明顯低于腫瘤對照組(P0.05),其他時間段比較均無統(tǒng)計學(xué)差異;DDP對照組小鼠瘤體積較ART治療組下降明顯,但差異不顯著。與腫瘤對照組小鼠各時間段瘤重相比,兩治療組均較其明顯下降(均P0.05),DDP對照組瘤重于第10d明顯低于ART治療組(P0.05)。瘤體積、瘤重呈現(xiàn)為DDP對照組ART治療組腫瘤對照組的總體趨勢。DDP對照組抑瘤率在各個時間段內(nèi)均較ART治療組高。ART治療組及DDP對照組小鼠生存時間與腫瘤對照組小鼠(38.0±2.79)d相比,均明顯延長(均P0.05);ART治療組生存時間(44.8±3.25)d較DDP對照組(47.3±3.89)d偏低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。小鼠生命延長率DDP對照組(24.47%)高于ART治療組(17.89%)。4 ART對小鼠脾淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)增殖的影響腫瘤對照組及兩治療組脾指數(shù)隨時間推移均有降低趨勢。腫瘤對照組小鼠在第10d時脾指數(shù)較正常對照組明顯增高(P0.05),其他時間點均有不同程度降低,但與正常對照組相比差異不顯著(均P0.05)。DDP對照組在第10d脾指數(shù)較正常對照組明顯升高(P0.05),在第40d時值較正常對照組顯著降低(P0.05),在20d、30d與正常對照組相比無差異;其各時間段值與腫瘤對照組相比均有所降低,在第40d時兩組相比有明顯差異(P0.05)。ART治療組從第20d開始脾指數(shù)較DDP對照組有一明顯回升(P0.05),且在第20d時顯著高于腫瘤對照組(P0.05),在第10d、20d時較正常對照組顯著增高(P0.05)。自20d后脾指數(shù)值呈現(xiàn)為DDP對照組腫瘤對照組正常對照組ART治療組的總體趨勢。腫瘤對照組及DDP對照組第20d、30d、40d的T淋巴細(xì)胞體外刺激指數(shù)SI明顯低于正常對照組(均P0.05),DDP對照組第10d、20d的SI值明顯低于腫瘤對照組(均P0.05)。ART治療組第20d、30d、40d的SI值較腫瘤對照組明顯回升(均P0.05);第10d、20d、40d時與DDP對照組相比SI也明顯回升(均P0.05);第30d時SI值較正常對照組明顯降低(P0.05),其他時間段兩組比較均無差異(均P0.05)。自20d起SI值大致呈現(xiàn)為DDP對照組腫瘤對照組ART治療組正常對照組的總體趨勢。5 ART對小鼠血清免疫抑制分子表達(dá)的影響與正常小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β1、PGE2含量相比,腫瘤對照組及兩治療組中各時間段內(nèi)上述含量均明顯升高(P0.05)。經(jīng)ART、DDP治療后的小鼠血清中IL-4、IL-6含量與腫瘤對照組相比無明顯差別(均P0.05)。DDP對照組與腫瘤對照組相比,IL-10含量無明顯差異;ART治療后,小鼠血清中IL-10含量較腫瘤對照組及DDP對照組明顯降低(均P0.05)。兩治療組小鼠血清中TGF-β1、PGE2含量與腫瘤對照組相比較均明顯降低(均P0.05),且ART治療組中TGF-β1、PGE2含量均低于DDP對照組(均P0.05)。結(jié)論:1 ART有抑制宮頸癌U14細(xì)胞體內(nèi)外增殖的作用,且隨著ART作用濃度的增加,抑制作用逐漸增強。2 ART可通過增強U14荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞功能發(fā)揮抗瘤活性。3 ART通過下調(diào)U14荷瘤小鼠血清中IL-10、TGF-β1、PGE2分泌而有效逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制,從而發(fā)揮針對宮頸癌的抗瘤活性。4 ART及DDP對U14移植瘤生長均有抑制作用,但ART對T淋巴細(xì)胞功能促進(jìn)作用及下調(diào)免疫抑制分子的作用均優(yōu)于DDP,且用藥后荷瘤小鼠耐受性強于DDP。
【關(guān)鍵詞】：青蒿琥酯 宮頸癌 U14 細(xì)胞增殖 免疫抑制分子 小鼠
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-14
• 英文縮寫14-15
• 前言15-16
• 材料與方法16-20
• 結(jié)果20-23
• 附圖23-33
• 附表33-40
• 討論40-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 綜述 宮頸癌的個體化綜合化治療進(jìn)展50-64
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 致謝64-65
• 個人簡歷65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：684566