發(fā)布時(shí)間：2017-08-16 16:38

  本文關(guān)鍵詞：Bufalin對(duì)食管癌中FAK活化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

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【摘要】：食管癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一,早期的轉(zhuǎn)移及侵襲是食管癌高死亡率的主要原因。黏著斑激酶(FAK),是一個(gè)125 k D的非受體型酪氨酸激酶,多項(xiàng)研究中均證實(shí),FAK在食管癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。近年來(lái),FAK在腫瘤干細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用逐漸成為研究的熱點(diǎn)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞受到細(xì)胞外因子刺激后向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程,細(xì)胞間連接減少,同時(shí)與細(xì)胞周圍基質(zhì)粘連減少,細(xì)胞骨架重構(gòu),細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增加。蟾蜍靈(Bufalin)是從傳統(tǒng)中藥蟾酥中提取的具有抗腫瘤作用的洋地黃類物質(zhì)。但是Bufalin在食管癌中的具體作用機(jī)制仍然不明確。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)Bufalin在食管癌中Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用作了大量實(shí)驗(yàn)研究,發(fā)現(xiàn)Bufalin可以通過(guò)下調(diào)ERK的磷酸化水平,發(fā)揮抗腫瘤作用。為了更好的了解食管癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn),研究了Bufalin對(duì)食管癌中FAK活化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響,從而進(jìn)一步探討B(tài)ufalin在食管癌中抗腫瘤的作用機(jī)制。目的:探討B(tài)ufalin對(duì)食管癌中FAK活化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。方法:1 RT-PCR方法檢測(cè)不同濃度Bufalin對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌ECA109細(xì)胞FAK、E-Cadherin、Vim m RNA表達(dá)的影響。2 Western Blot方法檢測(cè)不同濃度Bufalin對(duì)ECA109細(xì)胞FAK活化水平及FAK、E-Cadherin、Vim蛋白表達(dá)的影響。3采用劃痕愈合和Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度Bufalin對(duì)ECA 109細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響。4建立36只人食管鱗狀細(xì)胞癌ECA109細(xì)胞裸鼠原位移植瘤模型,隨機(jī)分為6組,即模型組、Bufalin低劑量組(0.5mg/kg,BL)、Bufalin中劑量組(1mg/kg,BM)、Bufalin高劑量組(1.5mg/kg,BH)、PF562271組(FAK抑制劑)、高劑量Bufalin與PF562271組聯(lián)合應(yīng)用組(BP),持續(xù)腹腔注射藥物30天。用藥期間觀察裸鼠飲食和精神狀態(tài)變化,記錄裸鼠體重和腫瘤大小數(shù)據(jù)。5用藥結(jié)束后處死全部裸鼠,測(cè)量腫瘤大小并計(jì)算腫瘤抑制率。6 HE染色檢測(cè)各組裸鼠移植瘤腫瘤組織鏡下表現(xiàn)。7 Real time-PCR檢測(cè)各組裸鼠移植瘤中FAK、E-Cadherin、Vim m RNA的表達(dá)。8免疫組化法檢測(cè)各組裸鼠移植瘤中FAK活化水平及FAK、E-Cadherin、Vim蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1 Bufalin對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌ECA109細(xì)胞FAK表達(dá)及活化水平的影響RT-PCR結(jié)果表明Bufalin抑制FAK m RNA的表達(dá)。陽(yáng)性對(duì)照組,20,40,60,80,100 nmol/L Bufalin及PF562271組,FAK m RNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.276±0.046,1.154±0.027,0.619±0.026,0.556±0.0172,0.439±0.022,0.221±0.0206,0.210±0.0285,與陽(yáng)性對(duì)照組相比,藥物干預(yù)組FAK相對(duì)表達(dá)量逐漸減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western Blot結(jié)果表明Bufalin抑制FAK的活化。陽(yáng)性對(duì)照組,20,40,60,80,100 nmol/L Bufalin及PF562271組,FAK的相對(duì)表達(dá)量分別為1.255±0.111,1.357±0.050,1.177±0.065,1.278±0.099,1.239±0.196,1.199±0.106,1.188±0.094,藥物干預(yù)組與陽(yáng)性對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);FAK活化水平的相對(duì)表達(dá)量分別為1.315±0.020,1.159±0.058,1.002±0.069,0.773±0.027,0.589±0.027,0.410±0.026,0.379±0.044,與陽(yáng)性對(duì)照組相比,藥物干預(yù)組FAK活化水平的相對(duì)表達(dá)量逐漸減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2 Bufalin對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌ECA109細(xì)胞EMT的影響RT-PCR結(jié)果表明Bufalin增加E-Cadherin m RNA的表達(dá),降低Vim m RNA的表達(dá)。陽(yáng)性對(duì)照組,20,40,60,80,100 nmol/L Bufalin及PF562271組,E-Cadherin m RNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.231±0.016,0.435±0.048,0.568±0.034,0.669±0.025,0.842±0.031,0.939±0.036,0.948±0.027,與陽(yáng)性對(duì)照組相比,藥物干預(yù)組相對(duì)表達(dá)量逐漸增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Vim m RNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.852±0.051,0.682±0.025,0.567±0.034,0.431±0.047,0.300±0.016,0.212±0.024,0.190±0.022,與陽(yáng)性對(duì)照組相比,藥物干預(yù)組的相對(duì)表達(dá)量逐漸減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western Blot結(jié)果表明Bufalin增加E-Cadherin蛋白的表達(dá),降低Vim蛋白的表達(dá)。陽(yáng)性對(duì)照組,20,40,60,80,100 nmol/L Bufalin及PF562271組,E-Cadherin的相對(duì)表達(dá)量分別為0.351±0.009,0.459±0.006,0.515±0.006,0.619±0.006,0.756±0.005,0.859±0.007,0.867±0.005,相對(duì)表達(dá)量逐漸增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Vim蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.257±0.043,1.150±0.038,0.854±0.032,0.754±0.025,0.621±0.028,0.552±0.034,0.539±0.040,相對(duì)表達(dá)量逐漸減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3 Bufalin對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌ECA109細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Bufalin可以抑制ECA109細(xì)胞的遷移及侵襲。藥物干預(yù)組(20,40,60,80,100 nmol/L Bufalin及PF562271組)與陽(yáng)性對(duì)照組相比較,劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞劃痕距離由1.156±0.118增加至1.556±0.249,2.981±0.167,3.685±0.121,4.614±0.170,5.316±0.104,5.795±0.178;Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示穿過(guò)基底膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)由107.00±8.19下降至78.67±3.06,61.67±3.06,42.67±3.512,24.33±2.517,10.33±3.215,9.00±2.65;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示穿過(guò)基底膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)由127.67±8.02下降至102.33±4.51,87.33±7.10,73.00±4.58,57.33±2.52,39.00±3.61,37.33±2.52,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中模型組、BL組、BM組、BH組、PF562271組、BP組裸鼠飲食及精神狀態(tài)未見異常;用藥前后各組裸鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5 Bufalin對(duì)裸鼠食管鱗狀細(xì)胞癌移植瘤生長(zhǎng)的影響模型組、BL組、BM組、BH組、PF562271組、BP組裸鼠腫瘤體積分別為2.430±0.052cm3,2.378±0.042cm3,1.805±0.052cm3,1.722±0.072cm3,1.703±0.062cm3,1.128±0.064cm3腫瘤體積逐漸減小,與模型組相比,BM組、BH組、PF562271組、BP組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。各用藥組的腫瘤抑制率分別為4.4%,45.6%,63.5%,65.2%,71.1%。6各組裸鼠原位移植瘤瘤組織HE染色鏡下特點(diǎn)各組裸鼠原位移植瘤瘤組織HE染色切片,均呈低分化鱗狀細(xì)胞癌的特點(diǎn),癌細(xì)胞異形性明顯,細(xì)胞形態(tài)多樣,排列成大小不等的實(shí)性巢,核大深染,核染色質(zhì)呈粗顆粒狀,核仁明顯,少見細(xì)胞間橋及角化。7 Bufalin對(duì)裸鼠食管鱗狀細(xì)胞癌原位移植瘤中FAK表達(dá)、活化水平及EMT的影響Real time-PCR結(jié)果表明Bufalin可以降低FAK的表達(dá),增加E-Cadherin的表達(dá),降低Vim的表達(dá)。BL組、BM組、BH組、PF562271組、BP組,各組FAK m RNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低,分別為0.956±0.015,0.677±0.041,0.516±0.019,0.480±0.015,0.343±0.022;各組E-Cadherin m RNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸增加,分別為1.137±0.140,1.840±0.095,2.593±30.127,2.600±0.151,3.245±0.100;各組Vim m RNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低,分別為1.004±0.033,0.791±0.027,0.540±0.026,0.501±0.015,0.399±0.023,與模型組相比,BM組、BH組、PF562271組、BP組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫組化結(jié)果表明Bufalin可以降低FAK的表達(dá)及活化,增加E-Cadherin的表達(dá),降低Vim的表達(dá)。模型組、BL組、BM組、BH組、PF562271組、BP組免疫組化結(jié)果:FAK免疫反應(yīng)積分平均秩次分別為49.20,46.70,36.35,24.60,20.10,6.05,FAK蛋白表達(dá)逐漸降低;FAK活化水平各組免疫反應(yīng)積分平均秩次分別為46.90,40.50,31.15,26.00,22.80,15.65,FAK活化水平逐漸降低;E-Cadherin免疫反應(yīng)積分平均秩次分別為8.75,14.00,24.40,40.60,42.5,52.75,E-Cadherin蛋白表達(dá)逐漸增加;Vim免疫反應(yīng)積分平均秩次分別為51.00,47.90,36.40,21.10,20.20,6.40,Vim蛋白表達(dá)逐漸降低,與模型組相比,BM組、BH組、PF562271組、BP組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1 Bufalin可以抑制ECA109細(xì)胞的遷移及侵襲。2 Bufalin可以抑制裸鼠食管鱗狀細(xì)胞癌移植瘤的生長(zhǎng)。3 Bufalin可以抑制食管鱗狀細(xì)胞癌中FAK的活化,提示Bufalin可能是通過(guò)下調(diào)FAK來(lái)抑制食管鱗狀細(xì)胞癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程。
【關(guān)鍵詞】：上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化 黏著斑激酶 Bufalin 食管鱗狀細(xì)胞癌 ECA109 裸鼠移植瘤
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.1
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-15
• 英文縮寫15-16
• 前言16-17
• 材料與方法17-31
• 結(jié)果31-35
• 附圖35-45
• 附表45-51
• 討論51-53
• 結(jié)論53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 綜述 黏著斑激酶與腫瘤的研究進(jìn)展57-68
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 致謝68-69
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 張學(xué)彥;呂成倩;杜冰;馬驍;關(guān)景明;高善玲;楊甜;常圓;;FAK在食管癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2014年08期

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本文編號(hào)：684378