本文關(guān)鍵詞：替加環(huán)素通過(guò)下調(diào)p21抑制黑色素瘤的增殖和轉(zhuǎn)移

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【摘要】：目的:惡性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)起源于神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞,其惡性程度高,易轉(zhuǎn)移,預(yù)后不佳。近些年來(lái),我國(guó)惡性黑色素瘤的發(fā)病率迅猛增長(zhǎng),已成為皮膚癌死亡的首要原因。目前治療黑色素瘤最主要的方法是手術(shù)切除,但黑色素瘤起病比較隱匿,多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移,錯(cuò)過(guò)了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。迄今為止,惡性黑色素瘤標(biāo)準(zhǔn)化療效果欠佳,包括手術(shù)在內(nèi)的多種治療方法仍未取得突破性進(jìn)展,因此尋求高效低毒的黑色素瘤治療藥物是目前急需解決的重要問(wèn)題。近年來(lái),抗生素作為常見(jiàn)藥,因其高效、低毒、價(jià)廉,已成為癌癥治療的新視點(diǎn)。有研究表明,四環(huán)素類抗生素及其衍生物具有抗腫瘤的生物活性。替加環(huán)素是第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)的第三代甘氨酰環(huán)素類抗生素,其結(jié)構(gòu)與四環(huán)素類藥物相似,是繼多西環(huán)素、米諾環(huán)素后開發(fā)的新一代抗生素。作為四環(huán)素類似物的替加環(huán)素,現(xiàn)已被用于腫瘤的輔助治療,如急性白血病、前列腺癌及其他腫瘤術(shù)后的治療。近年,已有研究表明替加環(huán)素在惡性血液腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及胃癌中具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用,但是對(duì)黑色素瘤的效應(yīng)及其作用機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。本課題以黑色素瘤為主要研究對(duì)象,通過(guò)體內(nèi)及體外多種實(shí)驗(yàn)手段探討替加環(huán)素抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的效應(yīng)及其具體的分子作用機(jī)理,為替加環(huán)素作為治療惡性黑色素瘤的臨床候選藥物提供更多的理論依據(jù)。方法:1采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT(四甲基偶氮唑藍(lán))比色法檢測(cè)不同濃度的替加環(huán)素(0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響,同時(shí)應(yīng)用Brd U免疫熒光對(duì)替加環(huán)素抑制A375和MV3細(xì)胞增殖情況進(jìn)行分析。2應(yīng)用PI單染流式細(xì)胞分析檢測(cè)替加環(huán)素對(duì)細(xì)胞周期的影響;不同濃度的替加環(huán)素(0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)處理后,應(yīng)用Western blot檢測(cè)周期相關(guān)蛋白的表達(dá),探討替加環(huán)素誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的機(jī)制。3應(yīng)用24h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)替加環(huán)素對(duì)人A375和MV3黑色素瘤細(xì)胞遷移侵襲能力的影響;不同濃度的替加環(huán)素(0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)處理后,應(yīng)用Western blot檢測(cè)遷移侵襲相關(guān)的EMT(上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)蛋白的表達(dá),探討替加環(huán)素抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制。4軟瓊脂克隆形成分析和小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證替加環(huán)素對(duì)人A375和MV3黑色素瘤細(xì)胞成瘤性的影響。5應(yīng)用慢病毒系統(tǒng)以慢病毒為載體上調(diào)p21的表達(dá)后應(yīng)用替加環(huán)素,檢測(cè)其對(duì)人A375和MV3惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖、周期、轉(zhuǎn)移和成瘤恢復(fù)性的影響。結(jié)果:1細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT結(jié)果均顯示:替加環(huán)素能抑制A375和MV3的細(xì)胞增殖,并呈現(xiàn)明顯的濃度(0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)依賴效應(yīng)關(guān)系,且藥物濃度越大其抑制作用越顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Brd U免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí),與對(duì)照組相比,替加環(huán)素處理組Brd U陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著降低(P0.05)。2 PI單染流式細(xì)胞分析顯示:與對(duì)照組相比,替加環(huán)素處理組細(xì)胞周期G0/G1期比例顯著增加(P0.05)。Western blot檢測(cè)相關(guān)周期蛋白顯示:與對(duì)照組相比,替加環(huán)素處理組的細(xì)胞周期蛋白CDK2和Cyclin E的表達(dá)量有所下調(diào);細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1(CDKN1A,p21CIP1/Waf1)的表達(dá)量也明顯下調(diào),并呈現(xiàn)明顯的濃度(0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)和時(shí)間(0h、24h、48h、72h)依賴效應(yīng)關(guān)系。3劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)均顯示:與對(duì)照組相比,替加環(huán)素處理組顯著抑制A375和MV3的遷移和侵襲,并呈現(xiàn)明顯的時(shí)間(24h、48h、72h)依賴效應(yīng)關(guān)系(P0.05);Western blot檢測(cè)相關(guān)遷移侵襲的EMT(上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)蛋白顯示:替加環(huán)素處理組的EMT蛋白E-Cadherin的表達(dá)量有所上調(diào),EMT蛋白Vimentin的表達(dá)量有所下調(diào),并呈現(xiàn)明顯的濃度(0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)和時(shí)間(0h、24h、48h、72h)依賴效應(yīng)關(guān)系。4軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示:與對(duì)照組相比,替加環(huán)素處理組克隆形成數(shù)顯著降低(P0.05);黑色素瘤細(xì)胞體內(nèi)異種移植NOD/SCID小鼠模型的研究結(jié)果顯示替加環(huán)素治療組的腫瘤體積和平均瘤重顯著低于對(duì)照組(P0.05)。5應(yīng)用慢病毒系統(tǒng)以慢病毒為載體上調(diào)p21的表達(dá)后顯示:與對(duì)照組(單一應(yīng)用DMSO或替加環(huán)素)相比,處理組(過(guò)表達(dá)p21后應(yīng)用替加環(huán)素)恢復(fù)了替加環(huán)素對(duì)A375和MV3惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖、周期、轉(zhuǎn)移和成瘤的抑制作用。結(jié)論:1本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)外研究證明替加環(huán)素通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,從而顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖;而且通過(guò)抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程,抑制黑色素瘤細(xì)胞遷移和侵襲;同時(shí)還明顯抑制黑色素瘤細(xì)胞克隆形成及小鼠體內(nèi)成瘤。因此替加環(huán)素可以作為治療黑色素瘤的一種有潛力的候選藥物。2 p21在黑色素瘤中具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。替加環(huán)素能下調(diào)p21的表達(dá),過(guò)表達(dá)p21后應(yīng)用替加環(huán)素,可以恢復(fù)單獨(dú)應(yīng)用藥物引起的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用。因此替加環(huán)素對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用依賴于p21,p21有望可以作為治療黑色素瘤的關(guān)鍵靶基因。
【關(guān)鍵詞】：惡性黑色素瘤 替加環(huán)素 p21~(CIP1/Waf1) 細(xì)胞增殖 細(xì)胞遷移 細(xì)胞侵襲
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-14
• 材料和方法14-28
• 結(jié)果28-32
• 附圖32-40
• 附表40-41
• 討論41-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 綜述 替加環(huán)素抑制黑色素瘤的研究進(jìn)展47-57
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 致謝57-58
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷58

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：673141