本文關(guān)鍵詞：人肝細(xì)胞癌中DEK基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 肝細(xì)胞癌 DEK 啟動(dòng)子 AP-2α轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

【摘要】：目的：DEK蛋白在多種人類侵襲性腫瘤中均出現(xiàn)過表達(dá),目前已被確認(rèn)為是一種癌基因,與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。前期研究結(jié)果顯示,DEK基因在人肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中的表達(dá)量明顯高于正常肝細(xì)胞,提示DEK可能在HCC的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用；同時(shí),DEK基因核心啟動(dòng)子序列(-167bp～+35bp)的甲基化水平在HCC細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞中存在顯著差異,且在HCC細(xì)胞系中普遍處于低甲基化狀態(tài)。鑒于目前對(duì)DEK基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究還比較少,因此本研究在前期工作基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)DEK基因核心啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析和后續(xù)研究,以確定調(diào)控該基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子,從而揭示DEK基因在人肝細(xì)胞癌中過表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。方法：基于前期的工作基礎(chǔ),本研究運(yùn)用在線軟件TFSEARCH 對(duì) DEK啟動(dòng)子CpG島區(qū)域可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)合DNA甲基化差異分析,初步篩選出對(duì)DEK基因核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點(diǎn)。之后,對(duì)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變和缺失突變來驗(yàn)證該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是維持DEK基因啟動(dòng)子活性的重要調(diào)控區(qū)。最后,利用siRNA干擾、轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)實(shí)驗(yàn)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)技術(shù)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的重要轉(zhuǎn)錄因子對(duì)DEK基因啟動(dòng)子活性及其轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控作用以及與DEK啟動(dòng)子在HCC細(xì)胞系中的相互作用。結(jié)果：雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示,DEK截短啟動(dòng)子序列中緊鄰轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的CpG2-2片段對(duì)DEK啟動(dòng)子活性影響最大。進(jìn)一步,TFSEARCH預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),CpG2-2區(qū)域存在AP-2a等轉(zhuǎn)錄因子的特異結(jié)合位點(diǎn),結(jié)合正常細(xì)胞與組織以及HCC細(xì)胞系中甲基化位點(diǎn)差異分析發(fā)現(xiàn)AP-2a結(jié)合位點(diǎn)的甲基化差異最大,因此我們預(yù)測(cè)AP-2a是調(diào)控DEK啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。之后,定點(diǎn)突變和缺失突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AP-2a轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)可明顯調(diào)控DEK核心啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性；進(jìn)一步的siRNA干擾、轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)實(shí)驗(yàn)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)結(jié)果顯示,在HCC細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄因子AP-2a可與DEK啟動(dòng)子區(qū)相互作用,并正向調(diào)控DEK基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。結(jié)論：綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們得出結(jié)論,AP-2a是人肝細(xì)胞癌中DEK基因過表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一,通過與DEK核心啟動(dòng)子區(qū)CpG2-2中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)相互作用,從而促進(jìn)HCC細(xì)胞系中DEK基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：肝細(xì)胞癌 DEK 啟動(dòng)子 AP-2α轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 1 引言13-19
• 1.1 肝細(xì)胞癌13
• 1.2 DEK蛋白13-14
• 1.3 啟動(dòng)子甲基化與基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)14-15
• 1.4 肝細(xì)胞癌中DEK基因相關(guān)研究15-16
• 1.5 研究意義16
• 1.6 研究目的和內(nèi)容16-17
• 1.6.1 研究目的16
• 1.6.2 研究?jī)?nèi)容16-17
• 1.7 技術(shù)路線17-19
• 2 實(shí)驗(yàn)材料19-25
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑19
• 2.1.1 細(xì)胞株19
• 2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)所用主要試劑19
• 2.2 細(xì)菌培養(yǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑19
• 2.2.1 細(xì)菌菌株19
• 2.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)所用主要試劑19
• 2.3 質(zhì)粒載體、siRNA以及RT-PCR引物序列19-21
• 2.3.1 質(zhì)粒載體19-20
• 2.3.2 siRNA以及RT-PCR引物序列20-21
• 2.4 主要試劑盒與相關(guān)試劑21-22
• 2.5 主要溶液的配制22-23
• 2.6 主要儀器設(shè)備23-25
• 3 實(shí)驗(yàn)方法25-39
• 3.1 HCC細(xì)胞系的復(fù)蘇、培養(yǎng)與凍存25-26
• 3.1.1 HCC細(xì)胞系的復(fù)蘇25
• 3.1.2 HCC細(xì)胞系的培養(yǎng)25
• 3.1.3 HCC細(xì)胞系的凍存25-26
• 3.2 HCC細(xì)胞系總RNA的提取以及RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平26-28
• 3.2.1 HCC細(xì)胞系總RNA的提取26-27
• 3.2.2 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平27-28
• 3.3 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)水平28-31
• 3.3.1 所用抗體的稀釋比及蛋白分子量大小28-29
• 3.3.2 HCC細(xì)胞系總蛋白的提取29
• 3.3.3 SDS-PAGE凝膠的配制29-30
• 3.3.4 SDS-PAGE凝膠電泳30
• 3.3.5 轉(zhuǎn)膜(半干轉(zhuǎn))以及封閉30-31
• 3.3.6 一抗、二抗孵育31
• 3.3.7 ECL化學(xué)反應(yīng)發(fā)光法顯影曝光31
• 3.4 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及提取31-34
• 3.4.1 感受態(tài)細(xì)胞(E.coli DH5α)的制備31-32
• 3.4.2 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及挑單克隆32
• 3.4.3 質(zhì)粒的提取32-33
• 3.4.4 轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒的提取33-34
• 3.5 轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞系34
• 3.6 AP-2α轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的定點(diǎn)突變與缺失突變34-35
• 3.7 染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)35-37
• 3.8 熒光素酶活性分析37-38
• 3.9 生物信息學(xué)分析38
• 3.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析38-39
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-47
• 4.1 HCC細(xì)胞系中DEK基因核心啟動(dòng)子序列中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析39
• 4.2 AP-2α轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是維持DEK基因啟動(dòng)子活性的重要調(diào)控區(qū)39-41
• 4.3 轉(zhuǎn)錄因子AP-2α對(duì)HCC細(xì)胞系中DEK核心啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響41-42
• 4.4 轉(zhuǎn)錄因子AP-2α對(duì)HCC細(xì)胞系中DEK基因表達(dá)水平的影響42-45
• 4.4.1 AP-2α siRNA干擾對(duì)HCC細(xì)胞系中DEK基因表達(dá)水平的影響42-44
• 4.4.2 AP-2α過表達(dá)對(duì)HCC細(xì)胞系中DEK基因表達(dá)水平的影響44-45
• 4.5 轉(zhuǎn)錄因子AP-2α與HCC細(xì)胞系中DEK啟動(dòng)子區(qū)的相互作用45-47
• 5 討論47-49
• 6 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 附錄A54-56
• 作者簡(jiǎn)歷及攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果56-58
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集58

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1 黃承誠(chéng);對(duì)19例人肝細(xì)胞癌癌組織中超氧化物歧化酶活性的研究[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1990年04期

2 張杰,劉軍建,韓云,張寧,芮靜安,金城,周柔麗;人肝細(xì)胞癌相關(guān)新基因的篩選[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2001年01期

3 彭濤;英國(guó)胃腸病學(xué)協(xié)會(huì)成人肝細(xì)胞癌診治指南(2003,節(jié)選)[J];廣西醫(yī)學(xué);2004年09期

4 陳葳,李旭,王瑩,張利平;抗人肝細(xì)胞癌單鏈抗體基因的構(gòu)建和表達(dá)[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年14期

5 葉昕;;人肝細(xì)胞癌中一種癌基因的分子克隆[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));1987年04期

6 張興榮;;年輕人肝細(xì)胞癌的臨床病理特點(diǎn)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊(cè));1991年05期

7 劉榮，吳孟超，張曉華，，陳漢，黃承誠(chéng);人肝細(xì)胞癌中表皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;1994年07期

8 楊少波;核蛋白類基因在人肝細(xì)胞癌中的變化及其意義[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(內(nèi)科學(xué)分冊(cè));1994年11期

9 韓新華,施公勝,王淼;表皮生長(zhǎng)因子受體在人肝細(xì)胞癌中的表達(dá)[J];交通醫(yī)學(xué);1999年02期

10 張利能,余強(qiáng),賀建宇,王麗影,查錫良;人肝細(xì)胞癌抑癌基因PTEN的缺失和突變分析[J];中華腫瘤雜志;2000年02期

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1 唐奇;劉悅芳;朱曉靜;張慧林;朱進(jìn);李玉華;張建平;馮振卿;管曉虹;;AlphaB-Crystallin基因在人肝細(xì)胞癌中的表達(dá)鑒定及臨床預(yù)后分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2007年學(xué)術(shù)年會(huì)暨第九屆全國(guó)病理大會(huì)論文匯編[C];2007年

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3 高愈希;陳春英;李柏;柴之芳;;應(yīng)用同步輻射X熒光分析人肝細(xì)胞癌組織細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中的金屬蛋白分布[A];第七屆全國(guó)核化學(xué)與放射化學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2005年

4 王宏程;韓克軍;石永玉;蘇艷榮;龐學(xué)雯;王瑜;陳慰峰;;人肝細(xì)胞癌相關(guān)腫瘤抗原的分離及鑒定[A];中國(guó)免疫學(xué)會(huì)第四屆學(xué)術(shù)大會(huì)會(huì)議議程及論文摘要集[C];2002年

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1 徐立斌;人肝細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制的研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2005年

2 張新;CD133在人肝細(xì)胞癌中的表達(dá)特點(diǎn)及其同患者臨床病理因素的關(guān)系[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2009年

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1 王千鳳;低氧誘導(dǎo)的ER應(yīng)激及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在人肝細(xì)胞癌中作用的初步研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

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5 朱海;廣西乙肝病毒/黃曲霉毒素B_1雙暴露人肝細(xì)胞癌中AKR1B10的表達(dá)[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2012年

6 陸健;骨橋蛋白在人肝細(xì)胞癌表達(dá)的臨床意義[D];南京醫(yī)科大學(xué);2006年

7 于宏川;COX-2在人肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與血管生成的關(guān)系及其臨床意義的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2008年

8 楊永江;缺氧誘導(dǎo)因子抑制劑（YC-1）對(duì)人肝細(xì)胞癌裸鼠移植瘤的影響及機(jī)制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2009年

9 李朋軍;人肝細(xì)胞癌DNA干系倍體異質(zhì)性的組織原位分析[D];暨南大學(xué);2005年

10 朱光能;人肝細(xì)胞癌與p53基因缺失及Occludin表達(dá)關(guān)系的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2003年

本文編號(hào)：653288