本文關(guān)鍵詞：人肝細胞癌中DEK基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究

  更多相關(guān)文章： 肝細胞癌 DEK 啟動子 AP-2α轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

【摘要】：目的：DEK蛋白在多種人類侵襲性腫瘤中均出現(xiàn)過表達,目前已被確認為是一種癌基因,與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。前期研究結(jié)果顯示,DEK基因在人肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中的表達量明顯高于正常肝細胞,提示DEK可能在HCC的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用；同時,DEK基因核心啟動子序列(-167bp～+35bp)的甲基化水平在HCC細胞系和正常肝細胞中存在顯著差異,且在HCC細胞系中普遍處于低甲基化狀態(tài)。鑒于目前對DEK基因的轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控機制研究還比較少,因此本研究在前期工作基礎(chǔ)上,進一步對DEK基因核心啟動子序列進行分析和后續(xù)研究,以確定調(diào)控該基因轉(zhuǎn)錄表達的重要轉(zhuǎn)錄因子,從而揭示DEK基因在人肝細胞癌中過表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。方法：基于前期的工作基礎(chǔ),本研究運用在線軟件TFSEARCH 對 DEK啟動子CpG島區(qū)域可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點進行預測,結(jié)合DNA甲基化差異分析,初步篩選出對DEK基因核心啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點。之后,對預測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行定點突變和缺失突變來驗證該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點是維持DEK基因啟動子活性的重要調(diào)控區(qū)。最后,利用siRNA干擾、轉(zhuǎn)錄因子過表達實驗和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)技術(shù)驗證預測的重要轉(zhuǎn)錄因子對DEK基因啟動子活性及其轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控作用以及與DEK啟動子在HCC細胞系中的相互作用。結(jié)果：雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示,DEK截短啟動子序列中緊鄰轉(zhuǎn)錄起始位點的CpG2-2片段對DEK啟動子活性影響最大。進一步,TFSEARCH預測結(jié)果發(fā)現(xiàn),CpG2-2區(qū)域存在AP-2a等轉(zhuǎn)錄因子的特異結(jié)合位點,結(jié)合正常細胞與組織以及HCC細胞系中甲基化位點差異分析發(fā)現(xiàn)AP-2a結(jié)合位點的甲基化差異最大,因此我們預測AP-2a是調(diào)控DEK啟動子轉(zhuǎn)錄活性的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。之后,定點突變和缺失突變實驗結(jié)果表明,AP-2a轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點可明顯調(diào)控DEK核心啟動子的轉(zhuǎn)錄活性；進一步的siRNA干擾、轉(zhuǎn)錄因子過表達實驗和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)結(jié)果顯示,在HCC細胞系中轉(zhuǎn)錄因子AP-2a可與DEK啟動子區(qū)相互作用,并正向調(diào)控DEK基因的轉(zhuǎn)錄表達。結(jié)論：綜上實驗結(jié)果我們得出結(jié)論,AP-2a是人肝細胞癌中DEK基因過表達的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一,通過與DEK核心啟動子區(qū)CpG2-2中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點相互作用,從而促進HCC細胞系中DEK基因的轉(zhuǎn)錄表達。
【關(guān)鍵詞】：肝細胞癌 DEK 啟動子 AP-2α轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
【學位授予單位】：北京交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 1 引言13-19
• 1.1 肝細胞癌13
• 1.2 DEK蛋白13-14
• 1.3 啟動子甲基化與基因的轉(zhuǎn)錄表達14-15
• 1.4 肝細胞癌中DEK基因相關(guān)研究15-16
• 1.5 研究意義16
• 1.6 研究目的和內(nèi)容16-17
• 1.6.1 研究目的16
• 1.6.2 研究內(nèi)容16-17
• 1.7 技術(shù)路線17-19
• 2 實驗材料19-25
• 2.1 細胞培養(yǎng)相關(guān)實驗材料及主要試劑19
• 2.1.1 細胞株19
• 2.1.2 細胞培養(yǎng)所用主要試劑19
• 2.2 細菌培養(yǎng)相關(guān)實驗材料及主要試劑19
• 2.2.1 細菌菌株19
• 2.2.2 細菌培養(yǎng)所用主要試劑19
• 2.3 質(zhì)粒載體、siRNA以及RT-PCR引物序列19-21
• 2.3.1 質(zhì)粒載體19-20
• 2.3.2 siRNA以及RT-PCR引物序列20-21
• 2.4 主要試劑盒與相關(guān)試劑21-22
• 2.5 主要溶液的配制22-23
• 2.6 主要儀器設(shè)備23-25
• 3 實驗方法25-39
• 3.1 HCC細胞系的復蘇、培養(yǎng)與凍存25-26
• 3.1.1 HCC細胞系的復蘇25
• 3.1.2 HCC細胞系的培養(yǎng)25
• 3.1.3 HCC細胞系的凍存25-26
• 3.2 HCC細胞系總RNA的提取以及RT-PCR檢測mRNA表達水平26-28
• 3.2.1 HCC細胞系總RNA的提取26-27
• 3.2.2 RT-PCR檢測mRNA表達水平27-28
• 3.3 Western blotting檢測蛋白表達水平28-31
• 3.3.1 所用抗體的稀釋比及蛋白分子量大小28-29
• 3.3.2 HCC細胞系總蛋白的提取29
• 3.3.3 SDS-PAGE凝膠的配制29-30
• 3.3.4 SDS-PAGE凝膠電泳30
• 3.3.5 轉(zhuǎn)膜(半干轉(zhuǎn))以及封閉30-31
• 3.3.6 一抗、二抗孵育31
• 3.3.7 ECL化學反應發(fā)光法顯影曝光31
• 3.4 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及提取31-34
• 3.4.1 感受態(tài)細胞(E.coli DH5α)的制備31-32
• 3.4.2 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及挑單克隆32
• 3.4.3 質(zhì)粒的提取32-33
• 3.4.4 轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒的提取33-34
• 3.5 轉(zhuǎn)染HCC細胞系34
• 3.6 AP-2α轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的定點突變與缺失突變34-35
• 3.7 染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)35-37
• 3.8 熒光素酶活性分析37-38
• 3.9 生物信息學分析38
• 3.10 統(tǒng)計學分析38-39
• 4 實驗結(jié)果39-47
• 4.1 HCC細胞系中DEK基因核心啟動子序列中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預測分析39
• 4.2 AP-2α轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點是維持DEK基因啟動子活性的重要調(diào)控區(qū)39-41
• 4.3 轉(zhuǎn)錄因子AP-2α對HCC細胞系中DEK核心啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響41-42
• 4.4 轉(zhuǎn)錄因子AP-2α對HCC細胞系中DEK基因表達水平的影響42-45
• 4.4.1 AP-2α siRNA干擾對HCC細胞系中DEK基因表達水平的影響42-44
• 4.4.2 AP-2α過表達對HCC細胞系中DEK基因表達水平的影響44-45
• 4.5 轉(zhuǎn)錄因子AP-2α與HCC細胞系中DEK啟動子區(qū)的相互作用45-47
• 5 討論47-49
• 6 結(jié)論49-50
• 參考文獻50-54
• 附錄A54-56
• 作者簡歷及攻讀碩士學位期間取得的研究成果56-58
• 學位論文數(shù)據(jù)集58

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 黃承誠;對19例人肝細胞癌癌組織中超氧化物歧化酶活性的研究[J];第二軍醫(yī)大學學報;1990年04期

2 張杰,劉軍建,韓云,張寧,芮靜安,金城,周柔麗;人肝細胞癌相關(guān)新基因的篩選[J];北京大學學報(醫(yī)學版);2001年01期

3 彭濤;英國胃腸病學協(xié)會成人肝細胞癌診治指南(2003,節(jié)選)[J];廣西醫(yī)學;2004年09期

4 陳葳,李旭,王瑩,張利平;抗人肝細胞癌單鏈抗體基因的構(gòu)建和表達[J];第四軍醫(yī)大學學報;2005年14期

5 葉昕;;人肝細胞癌中一種癌基因的分子克隆[J];國外醫(yī)學(分子生物學分冊);1987年04期

6 張興榮;;年輕人肝細胞癌的臨床病理特點[J];國外醫(yī)學(腫瘤學分冊);1991年05期

7 劉榮，吳孟超，張曉華，，陳漢，黃承誠;人肝細胞癌中表皮生長因子受體的表達[J];中華醫(yī)學雜志;1994年07期

8 楊少波;核蛋白類基因在人肝細胞癌中的變化及其意義[J];國外醫(yī)學(內(nèi)科學分冊);1994年11期

9 韓新華,施公勝,王淼;表皮生長因子受體在人肝細胞癌中的表達[J];交通醫(yī)學;1999年02期

10 張利能,余強,賀建宇,王麗影,查錫良;人肝細胞癌抑癌基因PTEN的缺失和突變分析[J];中華腫瘤雜志;2000年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 唐奇;劉悅芳;朱曉靜;張慧林;朱進;李玉華;張建平;馮振卿;管曉虹;;AlphaB-Crystallin基因在人肝細胞癌中的表達鑒定及臨床預后分析[A];中華醫(yī)學會病理學分會2007年學術(shù)年會暨第九屆全國病理大會論文匯編[C];2007年

2 王亞東;陳亞寶;朱家沂;嚴正;沈洪章;錢迎春;劉洪喜;周朋;趙晨星;湯曉懷;;核心巖藻糖基化γ-GT測定對人肝細胞癌的診斷價值[A];西部大開發(fā) 科教先行與可持續(xù)發(fā)展——中國科協(xié)2000年學術(shù)年會文集[C];2000年

3 高愈希;陳春英;李柏;柴之芳;;應用同步輻射X熒光分析人肝細胞癌組織細胞胞質(zhì)溶膠中的金屬蛋白分布[A];第七屆全國核化學與放射化學學術(shù)討論會論文摘要集[C];2005年

4 王宏程;韓克軍;石永玉;蘇艷榮;龐學雯;王瑜;陳慰峰;;人肝細胞癌相關(guān)腫瘤抗原的分離及鑒定[A];中國免疫學會第四屆學術(shù)大會會議議程及論文摘要集[C];2002年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 徐立斌;人肝細胞癌發(fā)生機制的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2005年

2 張新;CD133在人肝細胞癌中的表達特點及其同患者臨床病理因素的關(guān)系[D];第二軍醫(yī)大學;2009年

3 郝繼輝;人肝細胞癌血管內(nèi)皮生長因子及受體基因表達和其反義RNA體內(nèi)外抑瘤作用的研究[D];天津醫(yī)科大學;2002年

4 劉順芳;癌基因DJ-1在人肝細胞癌中的作用及其機制研究[D];華中科技大學;2011年

5 陳濤;靶向survivin基因治療人肝細胞癌的相關(guān)研究[D];第三軍醫(yī)大學;2002年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王千鳳;低氧誘導的ER應激及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在人肝細胞癌中作用的初步研究[D];安徽醫(yī)科大學;2015年

2 喬明旭;人肝細胞癌中DEK基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究[D];北京交通大學;2016年

3 盧鵬;熱休克轉(zhuǎn)錄因子1在人肝細胞癌中的表達及意義[D];第四軍醫(yī)大學;2012年

4 葉倫;抑癌基因PLAGL1在人肝細胞癌中的表達及其意義[D];華中科技大學;2011年

5 朱海;廣西乙肝病毒/黃曲霉毒素B_1雙暴露人肝細胞癌中AKR1B10的表達[D];廣西醫(yī)科大學;2012年

6 陸健;骨橋蛋白在人肝細胞癌表達的臨床意義[D];南京醫(yī)科大學;2006年

7 于宏川;COX-2在人肝細胞癌中的表達與血管生成的關(guān)系及其臨床意義的研究[D];廣西醫(yī)科大學;2008年

8 楊永江;缺氧誘導因子抑制劑（YC-1）對人肝細胞癌裸鼠移植瘤的影響及機制[D];河北醫(yī)科大學;2009年

9 李朋軍;人肝細胞癌DNA干系倍體異質(zhì)性的組織原位分析[D];暨南大學;2005年

10 朱光能;人肝細胞癌與p53基因缺失及Occludin表達關(guān)系的研究[D];安徽醫(yī)科大學;2003年

本文編號：653288