本文關鍵詞：Nur77的SUMO化修飾在乳腺癌細胞中的功能

  更多相關文章： Nur77 翻譯后修飾 SUMO ERα 乳腺癌

【摘要】：細胞核受體家族成員的數目繁多,它們通過對下游因子的調控,在細胞內形成強大有序的調節(jié)網絡。在細胞調節(jié)中,核受體家族成員大多受特異性配體激活,比較特殊的一類為孤兒核受體亞族,該亞族成員的配體未知或無需配體激活就能行使核受體功能。孤兒核受體家族NR4A (Nuclear receptor subfamily 4 group A)即屬于后者,其中Nur77(即NR4A1)的作用廣泛,多篇文獻報道了Nur77在神經發(fā)育、刺激應答等多領域的核心作用。近年來,Nur77在癌癥研究中的價值也開始顯現,在前列腺癌、肺癌、膀胱癌等的研究中,Nur77的異常表達,能夠影響癌癥發(fā)生。乳腺癌細胞中,Nur77的表達量遠高于正常的乳腺細胞,這種異常表達對乳腺癌的發(fā)生是否存在影響還尚未知曉。雌激素受體a (Estrogen receptor a, ERa)作為乳腺癌發(fā)病因子,是該病癥研究的主要核心。由此,在判斷Nur77對乳腺癌細胞影響的過程中,與ERa間的作用及聯系將成為研究的重點。作為小蛋白類泛素化修飾的SUMO化修飾(Small ubiquitin-related modifer, SUMO)與泛素化修飾在對底物蛋白的識別和位點結合過程中都存在競爭性,能夠極大地影響蛋白質的細胞內定位、穩(wěn)定性等。上文提及的NR4A家族成員中另一成員Nurr1(即NR4A2)已經證實可以受SUMO化修飾,在結構和功能上具有保守性的同家族成員Nur77的相關研究尚未開展。綜上,本研究重點在于Nur77作為ERα的輔激活因子促進乳腺癌細胞生長；同時,Nur77能被SUMO蛋白修飾,SUMO化對Nur77在乳腺癌細胞中的功能產生抑制作用。主要內容如下：1.通過對Nur77的氨基酸序列進行分析,賴氨酸K102和K557是潛在的SUMO化修飾位點。在Hela細胞中,通過免疫印跡和免疫共沉淀實驗確定了Nur77是SUMO化修飾的底物。接下來的免疫熒光驗證了兩者在細胞中存在共定位。為了進一步確定Nur77的SUMO化修飾位點,采用定點突變的方式,構建了3種不同的點突變體,單突變K102R、K577R,雙突變的2KR。后期的免疫共沉淀實驗中,與野生型的Nur77相比,突變體K577與2KR都無法與SUMO發(fā)生共價性的相互作用,確定主要修飾位點是K577。2. Hela細胞中,通過免疫共沉淀和免疫熒光實驗確定了ERa和Nur77間存在相互作用。接下來的熒光素酶報告基因實驗中顯示Nur77促進ERa的轉錄活性,并且呈劑量依賴性,推斷Nur77是ERα的輔激活因子,促進乳腺癌細胞增殖。3.通過免疫熒光、熒光素酶報告基因、細胞增殖MTT和克隆形成實驗,證明了SUMO化修飾對Nur77定位、轉錄活性都有影響,最終影響Nur77在ERa介導下對乳腺癌細胞增殖的促進作用�？傊�,本次研究將Nur77與雌激素受體聯系起來,并且確認了該蛋白可以被SUMO蛋白修飾,擴展了Nur77的功能研究,為乳腺癌治療提供了一個新的可能。
【關鍵詞】：Nur77 翻譯后修飾 SUMO ERα 乳腺癌
【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 目錄8-13
• 引言13-15
• 1 文獻綜述15-26
• 1.1 核受體超家族15-16
• 1.2 孤兒核受體Nur7716-20
• 1.2.1 簡介與結構16-17
• 1.2.2 Nur77參與的細胞調節(jié)17
• 1.2.3 Nur77的翻譯后修飾17-18
• 1.2.4 Nur77與癌癥18-20
• 1.3 雌激素受體α20-22
• 1.3.1 簡介與結構20-21
• 1.3.2 雌激素信號通路21-22
• 1.3.3 雌激素受體α與乳腺癌22
• 1.4 SUMO化修飾22-25
• 1.4.1 簡介22
• 1.4.2 SUMO化修飾的過程22-24
• 1.4.3 SUMO化修飾的功能24
• 1.4.4 SUMO化修飾與疾病24-25
• 1.5 論文選題依據及研究內容25-26
• 1.5.1 選題依據25
• 1.5.2 研究內容25-26
• 2 Nur77的SUMO化修飾26-37
• 2.1 引言26
• 2.2 儀器與試劑26-28
• 2.2.1 儀器26-27
• 2.2.2 試劑27
• 2.2.3 菌種、細胞27-28
• 2.3 實驗方法28-32
• 2.3.1 感受態(tài)細胞(DH5α)的制備28
• 2.3.2 轉化28
• 2.3.3 提取質粒28-29
• 2.3.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳實驗29
• 2.3.5 細胞培養(yǎng)29
• 2.3.6 細胞轉染29-30
• 2.3.7 細胞裂解30
• 2.3.8 考馬斯亮藍法測蛋白濃度30
• 2.3.9 蛋白質免疫共沉淀30
• 2.3.10 SDS-PAGE電泳30-31
• 2.3.11 濕法轉膜及曝光31-32
• 2.3.12 免疫熒光32
• 2.4 結果與分析32-36
• 2.4.1 Nur77的SUMO化位點軟件分析32-33
• 2.4.2 Hela細胞中Nur77的SUMO化33-34
• 2.4.3 Nur77 SUMO化共價性修飾的確定34
• 2.4.4 Nur77與SUMO在細胞中的定位34-36
• 2.5 討論36
• 2.6 小結36-37
• 3 Nur77的SUMO化修飾位點確定37-43
• 3.1 引言37
• 3.2 儀器與試劑37-38
• 3.2.1 儀器37
• 3.2.2 試劑37-38
• 3.2.3 菌種、細胞38
• 3.3 實驗方法38-41
• 3.3.1 Nur77單位點突變體的構建38-39
• 3.3.2 Nur77雙位點突變體的構建39-40
• 3.3.3 細胞培養(yǎng)40
• 3.3.4 細胞轉染40
• 3.3.5 細胞裂解40
• 3.3.6 考馬斯亮藍法測蛋白質濃度40
• 3.3.7 蛋白質免疫共沉淀40
• 3.3.8 SDS-PAGE電泳40
• 3.3.9 濕法轉膜及曝光40-41
• 3.4 結果與分析41-42
• 3.4.1 Nut77位點突變缺失體的表達41
• 3.4.2 Nur77的SUMO化修飾位點的確定41-42
• 3.5 討論42
• 3.6 小結42-43
• 4 乳腺癌細胞中SUMO化修飾對Nut77功能的影響43-49
• 4.1 引言43
• 4.2 儀器與試劑43
• 4.2.1 儀器43
• 4.2.2 試劑43
• 4.3 實驗方法43-45
• 4.3.1 細胞培養(yǎng)43
• 4.3.2 細胞轉染43
• 4.3.3 細胞裂解43
• 4.3.4 熒光素酶報告基因實驗43-44
• 4.3.5 細胞克隆體形成44
• 4.3.6 MTT細胞增殖實驗44-45
• 4.4 結果與分析45-48
• 4.4.1 SUMO化影響Nur77對下游靶基因的調節(jié)45
• 4.4.2 SUMO化影響Nur77對下游靶基因的調節(jié)有劑量依賴性45-46
• 4.4.3 SUMO化修飾影響Nur77在乳腺癌細胞克隆形成中的功能46-47
• 4.4.4 SUMO化修飾影響Nur77在乳腺癌細胞增殖中的功能47-48
• 4.5 討論48
• 4.6 小結48-49
• 5 Nur77與ERα間的相互作用及功能影響49-58
• 5.1 引言49
• 5.2 儀器與試劑49-50
• 5.2.1 儀器49
• 5.2.2 試劑49-50
• 5.3 實驗方法50-52
• 5.3.1 細胞培養(yǎng)50
• 5.3.2 細胞轉染50
• 5.3.3 細胞裂解50
• 5.3.4 考馬斯亮藍法測蛋白質濃度50
• 5.3.5 蛋白質免疫共沉淀50
• 5.3.6 SDS-PAGE電泳50
• 5.3.7 濕法轉膜及曝光50
• 5.3.8 免疫熒光50
• 5.3.9 熒光素酶報告基因實驗(E2刺激)50
• 5.3.10 反轉錄PCR50-52
• 5.3.11 DNA瓊脂糖凝膠電泳實驗52
• 5.4 結果與分析52-57
• 5.4.1 Hela細胞中Nur77與ERα間的相互作用52-53
• 5.4.2 Hela細胞中Nur77與ERα的亞細胞定位53-54
• 5.4.3 Nur77對ERα轉錄活性的影響54-55
• 5.4.4 Nut77對ERα轉錄活性的影響有劑量依賴性55-56
• 5.4.5 Nur77對ERα下游靶基因mRNA水平影響56-57
• 5.5 討論57
• 5.6 小結57-58
• 6 乳腺癌細胞中SUMO化修飾影響ERα介導下Nur77的功能58-63
• 6.1 引言58
• 6.2 儀器與試劑58
• 6.2.1 儀器58
• 6.2.2 試劑58
• 6.3 實驗方法58-59
• 6.3.1 細胞培養(yǎng)58
• 6.3.2 細胞轉染58
• 6.3.3 細胞裂解58
• 6.3.4 熒光素酶報告基因實驗58
• 6.3.5 細胞克隆體形成58-59
• 6.3.6 MTT細胞增殖實驗59
• 6.4 結果與分析59-62
• 6.4.1 SUMO化影響Nur77對ERa轉錄活性的調節(jié)59
• 6.4.2 SUMO化影響ERα介導的Nur77在乳腺癌細胞克隆體形成中的功能59-61
• 6.4.3 SUMO化影響ERα介導的Nur77在乳腺癌細胞增殖中的功能61-62
• 6.5 討論62
• 6.6 小結62-63
• 結論63-64
• 參考文獻64-69
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表學術論文情況69-70
• 致謝70-71

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4 王s，

本文編號：637854