本文關(guān)鍵詞：急性早幼粒白血病細(xì)胞中全反式維甲酸對(duì)UBA3表達(dá)的調(diào)控作用與機(jī)制

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【摘要】：背景:急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是一種較為罕見(jiàn)的疾病,是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的一種特殊類(lèi)型。它是目前人們認(rèn)識(shí)最清楚的惡性腫瘤之一,同時(shí)也是唯一一個(gè)能夠通過(guò)靶向療法治愈的惡性腫瘤。20世紀(jì)70年代,蒽環(huán)類(lèi)藥物的療法讓一些APL病人得到治愈,但易導(dǎo)致DNA損傷。直到1985年全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)的引入提升了這些病人的治療反應(yīng),并使這種疾病的預(yù)后獲得了革命性的進(jìn)步。臨床試驗(yàn)中,結(jié)合ATRA的現(xiàn)代治療方法使得超過(guò)90%的病人脫離治療并無(wú)病生存五年以上。ATRA在體內(nèi)和體外均可誘導(dǎo)APL細(xì)胞迅速分化為粒細(xì)胞,并且臨床上ATRA只需三到五周就能使APL病人緩解。ATRA發(fā)揮治療作用的機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn),至今尚未完全闡明。NEDD8(neural precursor cell expressed developmentally downregulated protein 8)是近年來(lái)研究比較熱的多種類(lèi)泛素蛋白中的一種,是一個(gè)僅包含81個(gè)氨基酸的小分子蛋白質(zhì),其與相應(yīng)底物共價(jià)結(jié)合的過(guò)程稱(chēng)為Neddylation。β淀粉樣蛋白前體蛋白結(jié)合蛋白1(amyloid-βprecursor protein binding protein 1,APPBP1)與類(lèi)泛素修飾活化酶3(ubiquitin-like modifier activating enzyme 3,UBA3)結(jié)合而成的異二聚體構(gòu)成Neddylation的活化酶E1,而UBA3在其中作為催化亞基,對(duì)Neddylation修飾的正常進(jìn)行至關(guān)重要。經(jīng)典的NEDD8底物是cullins,主要參與細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控;介導(dǎo)cullins發(fā)生Neddylation的E3連接酶是Rbx1(RING box protein 1),生成的Neddylated cullins(約90-100k Da)增強(qiáng)相應(yīng)酶復(fù)合體的活性。已有研究證明,腫瘤的發(fā)生發(fā)展很可能與Neddylation修飾系統(tǒng)的異常有關(guān)。NEDD8活化酶E1的特異性抑制因子MLN4924已經(jīng)在多種實(shí)體瘤和白血病中顯示具有很好的治療效果,進(jìn)入臨床II期研究。因此,靶向Neddylation修飾系統(tǒng)有望為未來(lái)癌癥治療帶來(lái)新的曙光。已有研究表明,Neddylation促進(jìn)AML細(xì)胞的生存和增殖,但是還不清楚Neddylation對(duì)APL細(xì)胞的分化有無(wú)影響,及在ATRA的治療效應(yīng)中具有怎樣的作用。為解答上述科學(xué)問(wèn)題,我們開(kāi)展了本課題研究。目的:在APL細(xì)胞中探索Neddylation參與ATRA治療作用的機(jī)制;探討ATRA對(duì)UBA3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制;探索UBA3在APL細(xì)胞惡性生長(zhǎng)中的作用及分子機(jī)制;探索APL治療的新靶點(diǎn)。方法:為了研究ATRA對(duì)UBA3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,以ATRA處理APL細(xì)胞系HL60及NB4細(xì)胞,通過(guò)Western Blot(WB)檢測(cè)Neddylation相關(guān)蛋白水平指標(biāo)Neddylated cullins、UBA3及APPBP1的表達(dá),通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QPCR)檢測(cè)UBA3的m RNA表達(dá)水平。為了研究ATRA調(diào)節(jié)UBA3表達(dá)的分子機(jī)制,用蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體抑制劑E64d/pepstatin A處理NB4及HL60細(xì)胞,WB檢測(cè)UBA3及Neddylated cullins的水平;用ATRA處理HL60及NB4細(xì)胞后,WB檢測(cè)自噬指標(biāo)LC3BII的表達(dá)情況;用自噬誘導(dǎo)劑rapamycin處理HL60及NB4細(xì)胞后,WB檢測(cè)LC3BII、UBA3及Neddylated cullins的表達(dá)情況。為研究Neddylation系統(tǒng)在APL細(xì)胞惡性生長(zhǎng)中的作用及其可能機(jī)制,通過(guò)NEDD8活化酶E1抑制劑MLN4924處理或者以短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,sh RNA)敲低UBA3抑制Neddylation,進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)分析檢測(cè)對(duì)惡性生長(zhǎng)的影響;凋亡檢測(cè)和細(xì)胞周期分析探討影響惡性生長(zhǎng)的機(jī)制;流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面Marker CD11b和吉姆薩染色揭示對(duì)APL細(xì)胞未分化狀態(tài)的影響。為分析經(jīng)典底物在其中的作用,我們用攜帶Rbx1 sh RNA的慢病毒感染HL60細(xì)胞,引起內(nèi)源性Rbx1的表達(dá)沉默進(jìn)而導(dǎo)致cullins Neddylation的減弱,并通過(guò)上述方法觀察其對(duì)HL60細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)、凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)程、形態(tài)及CD11b表達(dá)的影響。結(jié)果:1)ATRA抑制UBA3的表達(dá)WB檢測(cè)ATRA處理APL細(xì)胞株HL60及NB4細(xì)胞0d、1d、2d、3d、4d、5d后的UBA3的表達(dá)結(jié)果顯示:隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),UBA3的表達(dá)量逐漸降低,表明ATRA能夠抑制APL細(xì)胞中UBA3的表達(dá),并且呈時(shí)間依賴(lài)性。QPCR檢測(cè)ATRA處理HL60細(xì)胞0d、2d、3d、4d、5d后的UBA3的表達(dá)結(jié)果顯示:隨著時(shí)間的延長(zhǎng),UBA3的m RNA水平卻呈上升趨勢(shì),因此在ATRA處理APL細(xì)胞時(shí),UBA3的蛋白水平與其m RNA水平的變化是相反的,提示UBA3表達(dá)量的下降可能是蛋白穩(wěn)定性下降。2)ATRA通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制UBA3的表達(dá),進(jìn)而抑制Neddylation。蛋白酶體抑制劑MG132處理HL60細(xì)胞不能逆轉(zhuǎn)ATRA誘導(dǎo)的UBA3表達(dá)量下降,提示UBA3的下降不是通過(guò)蛋白酶體介導(dǎo)的。溶酶體抑制劑E64d/pepstatin A在HL60細(xì)胞里比較好的逆轉(zhuǎn)ATRA誘導(dǎo)的UBA3蛋白量下降,而且在NB4細(xì)胞中也有部分的逆轉(zhuǎn),提示ATRA是通過(guò)溶酶體途徑誘導(dǎo)UBA3蛋白量下降的。ATRA處理HL60及NB4細(xì)胞后,自噬指標(biāo)LC3BII上升,證實(shí)了ATRA能夠誘導(dǎo)自噬;而自噬誘導(dǎo)劑rapamycin處理HL60及NB4細(xì)胞后,UBA3及Neddylated cullins指標(biāo)均下降,提示ATRA通過(guò)誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)溶酶體活性進(jìn)而減弱UBA3蛋白的表達(dá)量。3)UBA3及其介導(dǎo)的Neddylation促進(jìn)APL細(xì)胞生長(zhǎng)、存活及細(xì)胞周期進(jìn)程,并維持其未分化狀態(tài)。通過(guò)MLN4924處理或者敲低UBA3抑制Neddylation,進(jìn)行如下分析:?生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析表明,MLN4924處理或者敲低UBA3均能夠顯著抑制HL60及NB4細(xì)胞的生長(zhǎng);軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)分析表明MLN4924能夠顯著抑制HL60及NB4細(xì)胞的集落形成能力。?凋亡檢測(cè)和細(xì)胞周期分析表明MLN4924處理或者敲低UBA3均能夠顯著促進(jìn)HL60及NB4細(xì)胞的凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)程阻滯。?吉姆薩染色結(jié)果表明MLN4924處理或者敲低UBA3均能夠使HL60及NB4細(xì)胞胞漿染色變淺、漿核比增加及胞漿空泡增多;表面Marker CD11b檢測(cè)結(jié)果分析表明MLN4924處理或者敲低UBA3均能夠誘導(dǎo)HL60及NB4細(xì)胞CD11b表達(dá)增加。因此,UBA3及其介導(dǎo)的Neddylation促進(jìn)APL細(xì)胞生長(zhǎng)、存活及細(xì)胞周期進(jìn)程,并維持其未分化狀態(tài)。4)UBA3及其介導(dǎo)的Neddylation通過(guò)經(jīng)典底物促進(jìn)APL細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)。敲低Rbx1后,生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析表明HL60細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制;凋亡檢測(cè)表明HL60細(xì)胞的凋亡增加;細(xì)胞周期進(jìn)程分析表明HL60細(xì)胞周期進(jìn)程阻滯在G0/G1期;吉姆薩染色結(jié)果表明HL60細(xì)胞胞漿染色變淺、漿核比增加及胞漿空泡增多;CD11b表面Marker檢測(cè)結(jié)果分析表明HL60細(xì)胞CD11b表達(dá)顯著增加。因此,敲低Rbx1以減弱cullins Neddylation具有和抑制整體Neddylation類(lèi)似的效應(yīng),提示Neddylation通過(guò)經(jīng)典底物cullins促進(jìn)APL細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)。結(jié)論:ATRA通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制UBA3的表達(dá),進(jìn)而抑制Neddylation。UBA3及其介導(dǎo)的Neddylation促進(jìn)APL細(xì)胞生長(zhǎng)、存活及細(xì)胞周期進(jìn)程,并維持其未分化狀態(tài)。對(duì)Neddylation的抑制作用是ATRA具有顯著治療效應(yīng)的重要機(jī)制。敲低Rbx1以減弱cullins Neddylation具有和抑制UBA3類(lèi)似的效應(yīng),提示Neddylation通過(guò)經(jīng)典底物cullins促進(jìn)APL細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)。本文創(chuàng)新點(diǎn):1)發(fā)現(xiàn)ATRA抑制UBA3表達(dá)。2)發(fā)現(xiàn)對(duì)Neddylation的抑制作用是ATRA具有顯著治療效應(yīng)的重要機(jī)制。3)發(fā)現(xiàn)Rbx1可能是APL治療的新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：APL ATRA Neddylation
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R733.71
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-14
• 英文縮略詞表14-15
• 前言15-19
• 材料與方法19-35
• 1 實(shí)驗(yàn)材料19-22
• 1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株19
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑19-20
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備20-21
• 1.4 常用試驗(yàn)試劑的配制21-22
• 2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟22-35
• 2.1 ATRA在APL細(xì)胞中對(duì)UBA3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用22-29
• 2.2 ATRA在APL細(xì)胞中調(diào)節(jié)UBA3表達(dá)的分子機(jī)制29-30
• 2.3 UBA3在APL細(xì)胞惡性生長(zhǎng)中的作用及機(jī)制30-34
• 2.4 UBA3影響APL細(xì)胞惡性生長(zhǎng)的分子機(jī)制探討34-35
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-44
• 1 ATRA在APL細(xì)胞中對(duì)UBA3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用35-36
• 1.1 WB檢測(cè)ATRA在HL60細(xì)胞中對(duì)UBA3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用的結(jié)果35
• 1.2 WB檢測(cè)ATRA在NB4細(xì)胞中對(duì)UBA3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用的結(jié)果35-36
• 1.3 QPCR檢測(cè)ATRA對(duì)APL細(xì)胞中UBA3 m RNA水平的影響的結(jié)果36
• 2 ATRA在APL細(xì)胞中抑制UBA3表達(dá)的分子機(jī)制36-39
• 2.1 WB檢測(cè)蛋白酶體途徑和溶酶體途徑在ATRA調(diào)節(jié)UBA3表達(dá)中的作用36-38
• 2.2 WB檢測(cè)自噬途徑在ATRA調(diào)節(jié)UBA3表達(dá)中的作用分析結(jié)果38-39
• 3 UBA3在APL細(xì)胞惡性生長(zhǎng)中的作用及機(jī)制39-42
• 3.1 集落形成及生長(zhǎng)曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UBA3對(duì)APL細(xì)胞惡性生長(zhǎng)的影響39-40
• 3.2 流式細(xì)胞術(shù)探討UBA3影響APL細(xì)胞惡性生長(zhǎng)的機(jī)制40-41
• 3.3 吉姆薩染色和流式細(xì)胞術(shù)揭示對(duì)APL細(xì)胞未分化狀態(tài)的影響的結(jié)果41-42
• 4 UBA3影響APL細(xì)胞惡性生長(zhǎng)的分子機(jī)制的檢測(cè)結(jié)果42-44
• 討論44-48
• 1 ATRA在APL細(xì)胞中對(duì)UBA3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用44-45
• 2 ATRA在APL細(xì)胞中抑制UBA3表達(dá)的分子機(jī)制45-46
• 2.1 蛋白酶體途徑和溶酶體途徑在ATRA調(diào)節(jié)UBA3表達(dá)中的作用分析45
• 2.2 自噬途徑在ATRA調(diào)節(jié)UBA3表達(dá)中的作用分析45-46
• 3 UBA3在APL細(xì)胞惡性生長(zhǎng)中的作用及機(jī)制46-47
• 3.1 UBA3對(duì)APL細(xì)胞惡性生長(zhǎng)的影響46
• 3.2 UBA3影響APL細(xì)胞惡性生長(zhǎng)的機(jī)制46
• 3.3 UBA3對(duì)APL細(xì)胞未分化狀態(tài)的影響46-47
• 4 UBA3影響APL細(xì)胞惡性生長(zhǎng)的分子機(jī)制47-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 綜述55-70
• 參考文獻(xiàn)61-70
• 碩士期間發(fā)表論文70-71
• 致謝71-73

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本文編號(hào)：629673