本文關(guān)鍵詞：急性早幼粒白血病細胞中全反式維甲酸對UBA3表達的調(diào)控作用與機制

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【摘要】：背景:急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是一種較為罕見的疾病,是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的一種特殊類型。它是目前人們認識最清楚的惡性腫瘤之一,同時也是唯一一個能夠通過靶向療法治愈的惡性腫瘤。20世紀70年代,蒽環(huán)類藥物的療法讓一些APL病人得到治愈,但易導致DNA損傷。直到1985年全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)的引入提升了這些病人的治療反應(yīng),并使這種疾病的預(yù)后獲得了革命性的進步。臨床試驗中,結(jié)合ATRA的現(xiàn)代治療方法使得超過90%的病人脫離治療并無病生存五年以上。ATRA在體內(nèi)和體外均可誘導APL細胞迅速分化為粒細胞,并且臨床上ATRA只需三到五周就能使APL病人緩解。ATRA發(fā)揮治療作用的機制一直是研究的熱點,至今尚未完全闡明。NEDD8(neural precursor cell expressed developmentally downregulated protein 8)是近年來研究比較熱的多種類泛素蛋白中的一種,是一個僅包含81個氨基酸的小分子蛋白質(zhì),其與相應(yīng)底物共價結(jié)合的過程稱為Neddylation。β淀粉樣蛋白前體蛋白結(jié)合蛋白1(amyloid-βprecursor protein binding protein 1,APPBP1)與類泛素修飾活化酶3(ubiquitin-like modifier activating enzyme 3,UBA3)結(jié)合而成的異二聚體構(gòu)成Neddylation的活化酶E1,而UBA3在其中作為催化亞基,對Neddylation修飾的正常進行至關(guān)重要。經(jīng)典的NEDD8底物是cullins,主要參與細胞周期和凋亡的調(diào)控;介導cullins發(fā)生Neddylation的E3連接酶是Rbx1(RING box protein 1),生成的Neddylated cullins(約90-100k Da)增強相應(yīng)酶復(fù)合體的活性。已有研究證明,腫瘤的發(fā)生發(fā)展很可能與Neddylation修飾系統(tǒng)的異常有關(guān)。NEDD8活化酶E1的特異性抑制因子MLN4924已經(jīng)在多種實體瘤和白血病中顯示具有很好的治療效果,進入臨床II期研究。因此,靶向Neddylation修飾系統(tǒng)有望為未來癌癥治療帶來新的曙光。已有研究表明,Neddylation促進AML細胞的生存和增殖,但是還不清楚Neddylation對APL細胞的分化有無影響,及在ATRA的治療效應(yīng)中具有怎樣的作用。為解答上述科學問題,我們開展了本課題研究。目的:在APL細胞中探索Neddylation參與ATRA治療作用的機制;探討ATRA對UBA3表達的調(diào)節(jié)作用及分子機制;探索UBA3在APL細胞惡性生長中的作用及分子機制;探索APL治療的新靶點。方法:為了研究ATRA對UBA3表達的調(diào)節(jié)作用,以ATRA處理APL細胞系HL60及NB4細胞,通過Western Blot(WB)檢測Neddylation相關(guān)蛋白水平指標Neddylated cullins、UBA3及APPBP1的表達,通過實時熒光定量PCR(QPCR)檢測UBA3的m RNA表達水平。為了研究ATRA調(diào)節(jié)UBA3表達的分子機制,用蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體抑制劑E64d/pepstatin A處理NB4及HL60細胞,WB檢測UBA3及Neddylated cullins的水平;用ATRA處理HL60及NB4細胞后,WB檢測自噬指標LC3BII的表達情況;用自噬誘導劑rapamycin處理HL60及NB4細胞后,WB檢測LC3BII、UBA3及Neddylated cullins的表達情況。為研究Neddylation系統(tǒng)在APL細胞惡性生長中的作用及其可能機制,通過NEDD8活化酶E1抑制劑MLN4924處理或者以短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,sh RNA)敲低UBA3抑制Neddylation,進行細胞生長曲線分析和軟瓊脂集落形成實驗分析檢測對惡性生長的影響;凋亡檢測和細胞周期分析探討影響惡性生長的機制;流式細胞儀檢測表面Marker CD11b和吉姆薩染色揭示對APL細胞未分化狀態(tài)的影響。為分析經(jīng)典底物在其中的作用,我們用攜帶Rbx1 sh RNA的慢病毒感染HL60細胞,引起內(nèi)源性Rbx1的表達沉默進而導致cullins Neddylation的減弱,并通過上述方法觀察其對HL60細胞生長曲線、凋亡、細胞周期進程、形態(tài)及CD11b表達的影響。結(jié)果:1)ATRA抑制UBA3的表達WB檢測ATRA處理APL細胞株HL60及NB4細胞0d、1d、2d、3d、4d、5d后的UBA3的表達結(jié)果顯示:隨著作用時間的延長,UBA3的表達量逐漸降低,表明ATRA能夠抑制APL細胞中UBA3的表達,并且呈時間依賴性。QPCR檢測ATRA處理HL60細胞0d、2d、3d、4d、5d后的UBA3的表達結(jié)果顯示:隨著時間的延長,UBA3的m RNA水平卻呈上升趨勢,因此在ATRA處理APL細胞時,UBA3的蛋白水平與其m RNA水平的變化是相反的,提示UBA3表達量的下降可能是蛋白穩(wěn)定性下降。2)ATRA通過誘導自噬抑制UBA3的表達,進而抑制Neddylation。蛋白酶體抑制劑MG132處理HL60細胞不能逆轉(zhuǎn)ATRA誘導的UBA3表達量下降,提示UBA3的下降不是通過蛋白酶體介導的。溶酶體抑制劑E64d/pepstatin A在HL60細胞里比較好的逆轉(zhuǎn)ATRA誘導的UBA3蛋白量下降,而且在NB4細胞中也有部分的逆轉(zhuǎn),提示ATRA是通過溶酶體途徑誘導UBA3蛋白量下降的。ATRA處理HL60及NB4細胞后,自噬指標LC3BII上升,證實了ATRA能夠誘導自噬;而自噬誘導劑rapamycin處理HL60及NB4細胞后,UBA3及Neddylated cullins指標均下降,提示ATRA通過誘導自噬增強溶酶體活性進而減弱UBA3蛋白的表達量。3)UBA3及其介導的Neddylation促進APL細胞生長、存活及細胞周期進程,并維持其未分化狀態(tài)。通過MLN4924處理或者敲低UBA3抑制Neddylation,進行如下分析:?生長曲線分析表明,MLN4924處理或者敲低UBA3均能夠顯著抑制HL60及NB4細胞的生長;軟瓊脂集落形成實驗分析表明MLN4924能夠顯著抑制HL60及NB4細胞的集落形成能力。?凋亡檢測和細胞周期分析表明MLN4924處理或者敲低UBA3均能夠顯著促進HL60及NB4細胞的凋亡、誘導細胞周期進程阻滯。?吉姆薩染色結(jié)果表明MLN4924處理或者敲低UBA3均能夠使HL60及NB4細胞胞漿染色變淺、漿核比增加及胞漿空泡增多;表面Marker CD11b檢測結(jié)果分析表明MLN4924處理或者敲低UBA3均能夠誘導HL60及NB4細胞CD11b表達增加。因此,UBA3及其介導的Neddylation促進APL細胞生長、存活及細胞周期進程,并維持其未分化狀態(tài)。4)UBA3及其介導的Neddylation通過經(jīng)典底物促進APL細胞的惡性生長。敲低Rbx1后,生長曲線分析表明HL60細胞的生長受到顯著抑制;凋亡檢測表明HL60細胞的凋亡增加;細胞周期進程分析表明HL60細胞周期進程阻滯在G0/G1期;吉姆薩染色結(jié)果表明HL60細胞胞漿染色變淺、漿核比增加及胞漿空泡增多;CD11b表面Marker檢測結(jié)果分析表明HL60細胞CD11b表達顯著增加。因此,敲低Rbx1以減弱cullins Neddylation具有和抑制整體Neddylation類似的效應(yīng),提示Neddylation通過經(jīng)典底物cullins促進APL細胞的惡性生長。結(jié)論:ATRA通過誘導自噬抑制UBA3的表達,進而抑制Neddylation。UBA3及其介導的Neddylation促進APL細胞生長、存活及細胞周期進程,并維持其未分化狀態(tài)。對Neddylation的抑制作用是ATRA具有顯著治療效應(yīng)的重要機制。敲低Rbx1以減弱cullins Neddylation具有和抑制UBA3類似的效應(yīng),提示Neddylation通過經(jīng)典底物cullins促進APL細胞的惡性生長。本文創(chuàng)新點:1)發(fā)現(xiàn)ATRA抑制UBA3表達。2)發(fā)現(xiàn)對Neddylation的抑制作用是ATRA具有顯著治療效應(yīng)的重要機制。3)發(fā)現(xiàn)Rbx1可能是APL治療的新靶點。
【關(guān)鍵詞】：APL ATRA Neddylation
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-14
• 英文縮略詞表14-15
• 前言15-19
• 材料與方法19-35
• 1 實驗材料19-22
• 1.1 實驗細胞株19
• 1.2 主要實驗試劑19-20
• 1.3 主要實驗儀器設(shè)備20-21
• 1.4 常用試驗試劑的配制21-22
• 2 實驗方法和步驟22-35
• 2.1 ATRA在APL細胞中對UBA3表達的調(diào)節(jié)作用22-29
• 2.2 ATRA在APL細胞中調(diào)節(jié)UBA3表達的分子機制29-30
• 2.3 UBA3在APL細胞惡性生長中的作用及機制30-34
• 2.4 UBA3影響APL細胞惡性生長的分子機制探討34-35
• 實驗結(jié)果35-44
• 1 ATRA在APL細胞中對UBA3表達的調(diào)節(jié)作用35-36
• 1.1 WB檢測ATRA在HL60細胞中對UBA3表達的調(diào)節(jié)作用的結(jié)果35
• 1.2 WB檢測ATRA在NB4細胞中對UBA3表達的調(diào)節(jié)作用的結(jié)果35-36
• 1.3 QPCR檢測ATRA對APL細胞中UBA3 m RNA水平的影響的結(jié)果36
• 2 ATRA在APL細胞中抑制UBA3表達的分子機制36-39
• 2.1 WB檢測蛋白酶體途徑和溶酶體途徑在ATRA調(diào)節(jié)UBA3表達中的作用36-38
• 2.2 WB檢測自噬途徑在ATRA調(diào)節(jié)UBA3表達中的作用分析結(jié)果38-39
• 3 UBA3在APL細胞惡性生長中的作用及機制39-42
• 3.1 集落形成及生長曲線實驗檢測UBA3對APL細胞惡性生長的影響39-40
• 3.2 流式細胞術(shù)探討UBA3影響APL細胞惡性生長的機制40-41
• 3.3 吉姆薩染色和流式細胞術(shù)揭示對APL細胞未分化狀態(tài)的影響的結(jié)果41-42
• 4 UBA3影響APL細胞惡性生長的分子機制的檢測結(jié)果42-44
• 討論44-48
• 1 ATRA在APL細胞中對UBA3表達的調(diào)節(jié)作用44-45
• 2 ATRA在APL細胞中抑制UBA3表達的分子機制45-46
• 2.1 蛋白酶體途徑和溶酶體途徑在ATRA調(diào)節(jié)UBA3表達中的作用分析45
• 2.2 自噬途徑在ATRA調(diào)節(jié)UBA3表達中的作用分析45-46
• 3 UBA3在APL細胞惡性生長中的作用及機制46-47
• 3.1 UBA3對APL細胞惡性生長的影響46
• 3.2 UBA3影響APL細胞惡性生長的機制46
• 3.3 UBA3對APL細胞未分化狀態(tài)的影響46-47
• 4 UBA3影響APL細胞惡性生長的分子機制47-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻49-55
• 綜述55-70
• 參考文獻61-70
• 碩士期間發(fā)表論文70-71
• 致謝71-73

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本文編號：629673