本文關(guān)鍵詞：齊墩果酸誘導(dǎo)人類(lèi)胃癌細(xì)胞自噬性死亡機(jī)制的研究

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【摘要】：齊墩果酸(oleanolic acid, OA)是一種植物來(lái)源的五環(huán)的萜類(lèi)化合物。廣泛分布于自然界藥本植物的果實(shí)和葉片中。本論文首先通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),OA對(duì)于人類(lèi)胃癌細(xì)胞SGC-7901、MGC-803和BGC-823具有良好的抑制作用。由于之前的報(bào)道中,OA對(duì)其它癌細(xì)胞的抑制作用多通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞凋亡。因此實(shí)驗(yàn)通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染和caspase-3活性測(cè)定的方法檢測(cè)OA是否在胃癌細(xì)胞中也引起了凋亡。結(jié)果證明,OA誘發(fā)的胃癌細(xì)胞死亡并不通過(guò)凋亡途徑。凋亡抑制劑z-VAD不能抑制OA引起的胃癌細(xì)胞死亡進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)OA誘導(dǎo)了胃癌細(xì)胞SGC-7901、MGC-803和BGC823的自噬途徑。我們首先檢測(cè)到OA處理的胃癌細(xì)胞中,自噬起始蛋白Beclin-1和自噬體形成蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)大量增加。在轉(zhuǎn)染GFP-RFP-LC3質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞中,相比空白組細(xì)胞, OA處理組可通過(guò)共聚焦顯微鏡檢測(cè)到大量被GRF和RFP熒光標(biāo)記的自噬體。進(jìn)一步通過(guò)透射電鏡的直接檢測(cè),也觀察到加藥組胃癌細(xì)胞中大量自噬體的形成。同時(shí)通過(guò)自噬抑制劑3-MA和Beclin-1 siRNA阻止OA引發(fā)的自噬作用,發(fā)現(xiàn)OA引起的細(xì)胞死亡也被抑制。因此得出結(jié)論,OA對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901、MGC-803和BGC823的抑制是通過(guò)誘導(dǎo)其自噬性死亡。mTOR是細(xì)胞中調(diào)控自噬的重要因子,mTOR的磷酸化修飾受到抑制是自噬起始的標(biāo)志。mTOR在自噬途徑中受到PI3K/AKT,ERK/MAPK,AMPK途徑的調(diào)控。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)OA處理的細(xì)胞中,PI3K/AKT,ERK/MAPK途徑受到抑制,AMPK途徑被激活,這些結(jié)果都導(dǎo)致了mTOR的磷酸化受到抑制,并導(dǎo)致自噬的產(chǎn)生。進(jìn)一步的研究表明,OA也誘導(dǎo)了線粒體膜電位的崩解和ROS升高。而還原劑NAC能降低細(xì)胞ROS的水平但不能阻止線粒體膜電位崩解和細(xì)胞的自噬,暗示ROS升高可能只是由于線粒體膜電位崩解導(dǎo)致線粒體ROS外泄的結(jié)果。我們猜測(cè)膜電位的崩解可能與OA誘導(dǎo)的自噬性死亡相關(guān),而線粒體孔道蛋白可能參與了這一過(guò)程。而后我們定位到了線粒體孔道蛋白CypD,因?yàn)樵诩尤隒ypD的抑制劑CsA或利用siRNA沉默CypD后,不僅有效的抑制了線粒體膜電位的崩解,并且有效地阻止了OA誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和自噬性死亡。因此可認(rèn)定CypD是OA作用的重要靶位點(diǎn)。本文首次揭示齊墩果酸在胃癌細(xì)胞中誘發(fā)了自噬性死亡,這條自噬途徑是通過(guò)抑制PI3K/AKT、ERK/MAPK通路,激活A(yù)MPK通路并最終導(dǎo)致mTOR的去磷酸化實(shí)現(xiàn)的。而線粒體孔道蛋白CypD是OA一個(gè)重要靶位點(diǎn),OA與CypD作用導(dǎo)致了線粒體膜電位的崩解并最終導(dǎo)致了胃癌細(xì)胞自噬性死亡的發(fā)生。這項(xiàng)研究為齊墩果酸用于胃癌的治療提供了重要的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：齊墩果酸 自噬 mTOR 線粒體膜電位 CypD
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 致謝8-9
• 摘要9-11
• Abstract11-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-36
• 1 胃癌的現(xiàn)狀及防治14-17
• 2 齊墩果酸的生物學(xué)活性17-20
• 3 細(xì)胞自噬20-26
• 3.1 概述20-21
• 3.2 自噬體的形成21-22
• 3.3 自噬的調(diào)控22-23
• 3.4 自噬信號(hào)通路23-25
• 3.5 自噬與細(xì)胞生存25-26
• 4 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔蛋白26-28
• 4.1 概述26
• 4.2 腺嘌呤核苷酸移位酶26-27
• 4.3 電壓依賴(lài)性陰離子通道27
• 4.4 親環(huán)素D27
• 4.5 線粒體ATP合酶27
• 4.6 Bax/Bak蛋白27-28
• 5 小結(jié)與展望28-30
• 參考文獻(xiàn)30-36
• 第二章 齊墩果酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬性死亡實(shí)驗(yàn)的材料和方法36-49
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑36-41
• 1.1 細(xì)胞株36
• 1.2 藥品36
• 1.3 試劑材料36-38
• 1.4 設(shè)備38-39
• 1.5 實(shí)驗(yàn)主要試劑配制39-41
• 2 實(shí)驗(yàn)方法41-47
• 2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代和凍存41-42
• 2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性42
• 2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀態(tài)42-43
• 2.4 Caspase-3活性檢測(cè)43-44
• 2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平44-45
• 2.6 GFP-RFP-LC3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染45-46
• 2.7 透射電子顯微鏡觀察自噬體46
• 2.8 小RNA干涉實(shí)驗(yàn)46
• 2.9 線粒體膜電位的測(cè)定46-47
• 2.10 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平47
• 3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理47-48
• 參考文獻(xiàn)48-49
• 第三章 齊墩果酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的自噬性死亡49-70
• 1 齊墩果酸對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用49-51
• 2 齊墩果酸未誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡途徑51-54
• 2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)齊墩果酸處理后胃癌細(xì)胞的凋亡狀態(tài)51-52
• 2.2 齊墩果酸處理后胃癌細(xì)胞Caspase-3活性的檢測(cè)52-54
• 3 齊墩果酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬的檢測(cè)54-60
• 3.1 齊墩果酸誘導(dǎo)自噬關(guān)鍵蛋白的上調(diào)54-55
• 3.2 激光共聚焦顯微鏡檢查齊墩果酸誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬55-59
• 3.3 透射電鏡觀察齊墩果酸處理后胃癌細(xì)胞形成的自噬體59-60
• 4 齊墩果酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的自噬性死亡60-64
• 4.1 Beclin-1 siRNA有效沉默Beclin-1的表達(dá)60-61
• 4.2 Beclin-1 siRNA有效抑制齊墩果酸引起的自噬61-62
• 4.3 Beclin-1 siRNA和3-MA有效抑制齊墩果酸對(duì)胃癌細(xì)胞的毒性62-64
• 5 齊墩果酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬的信號(hào)途徑64-69
• 參考文獻(xiàn)69-70
• 第四章 齊墩果酸通過(guò)線粒體膜蛋白CypD介導(dǎo)細(xì)胞的自噬性死亡70-86
• 1 齊墩果酸誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體膜電位降低和ROS升高70-76
• 1.1 齊墩果酸誘導(dǎo)線粒體膜電位降低70-74
• 1.2 齊墩果酸導(dǎo)致胃癌細(xì)胞ROS上升74-76
• 2 齊墩果酸通過(guò)CypD介導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬性死亡76-85
• 2.1 CsA抑制齊墩果酸引起的細(xì)胞毒性76-78
• 2.2 CsA抑制齊墩果酸誘導(dǎo)的自噬作用78-81
• 2.3 CypD siRNA能有效沉默CypD的表達(dá)81-82
• 2.4 CypD siRNA能有效抑制齊墩果酸引起的細(xì)胞毒性82-83
• 2.5 CypD siRNA能有效抑制齊墩果酸引起的細(xì)胞自噬83-85
• 參考文獻(xiàn)85-86
• 第五章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論86-92
• 1 結(jié)果與討論86-89
• 2 創(chuàng)新點(diǎn)89-90
• 參考文獻(xiàn)90-92
• 中英詞匯縮略92-93
• 簡(jiǎn)歷93

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本文編號(hào)：615090