本文關(guān)鍵詞：缺氧誘導(dǎo)胃癌AGS細(xì)胞中microRNA-574-3p表達(dá)的研究

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【摘要】：研究背景:胃癌是一種很常見(jiàn)的惡性腫瘤,在我國(guó)消化道惡性腫瘤發(fā)生率中處于第一位,而死亡率在我國(guó)惡性腫瘤中也排名第三位。胃癌死亡率高的原因大多數(shù)是由于早期胃癌不容易被發(fā)現(xiàn),而晚期胃癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移則是影響其預(yù)后的關(guān)鍵因素。當(dāng)腫瘤形成時(shí),腫瘤周圍所處的微環(huán)境是腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的一個(gè)重要因素。而這種微環(huán)境很容易使胃癌細(xì)胞處于一個(gè)缺氧的狀態(tài),引發(fā)缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)。缺氧誘導(dǎo)因子在腫瘤細(xì)胞中是非常重要的轉(zhuǎn)錄因子,它是許多腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要基因,其中缺氧誘導(dǎo)因子調(diào)控micro RNA(mi RNA)的表達(dá)。有關(guān)mi RNA的報(bào)道有很多,它在腫瘤的整個(gè)形成過(guò)程,包括生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)、分化、凋亡等過(guò)程中都起著調(diào)控作用。我們今天來(lái)探討胃癌AGS細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下mi R-574-3p表達(dá)。材料和方法:本文采用了胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS細(xì)胞作為研究的基礎(chǔ),通過(guò)用Co Cl2刺激和在缺氧培養(yǎng)箱的培養(yǎng)下來(lái)完成本實(shí)驗(yàn)的所有研究。實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同Co Cl2的濃度來(lái)摸索最適濃度,根據(jù)不同氧氣濃度來(lái)摸索最適的一種缺氧狀態(tài),分別采用最適濃度Co Cl2(200mM)和最適氧氣(5%O2)來(lái)進(jìn)一步研究。我們采用干擾和激活HIF-1α的表達(dá)正反兩方面來(lái)研究,采用HIF-1α抑制劑和si-RNA的方法來(lái)從反面證實(shí)HIF-1α能夠引起mi R-574-3p的上調(diào),我們轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α的質(zhì)粒,通過(guò)在常氧下穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α來(lái)看mi R-574-3p的表達(dá)情況。我們采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)確定HIF-1α能夠直接作用于mi R-574-3p上游啟動(dòng)子區(qū)域。我們通過(guò)瞬轉(zhuǎn)mi R-574-3p看AGS細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)情況。結(jié)果:首先我們利用在環(huán)境中缺氧和氯化鈷模擬缺氧的狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)mi R-574-3p的表達(dá)增加,在氯化鈷刺激下,三次的統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析:mi R-574-3p表達(dá)量增加了2.18倍;而在缺氧狀態(tài)下,三次的統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析:mi R-574-3p表達(dá)量增加了1.93倍;為了進(jìn)一步證實(shí)mi R-574-3p的增加是由HIF-1α引起的,我們采用了抑制劑和si-RNA通過(guò)阻斷HIF-1α的表達(dá)來(lái)證實(shí)此問(wèn)題。三次結(jié)果分析:在氯化鈷和缺氧狀態(tài)下抑制劑分別降低約40%和29%,而在氯化鈷和缺氧狀態(tài)下si-RNA分別降低約30%和36%。而且我們還采用了轉(zhuǎn)染HIF-1α的質(zhì)粒,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后mi R-574-3p的表達(dá)量增加了2.15倍;我們?cè)囉秒p熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)后,HIF-1α直接mi R-574-3p上游約1000bp的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。我們瞬轉(zhuǎn)mi R-574-3p質(zhì)粒會(huì)引起HIF-1α的表達(dá)增加1.3倍。結(jié)論:研究表明缺氧條件下通過(guò)HIF-1α能夠上調(diào)胃癌AGS細(xì)胞的mi R-574-3p表達(dá),并且HIF-1α直接作用于mi R-574-3p上游啟動(dòng)子區(qū)域,mi R-574-3p表達(dá)的增加可以上調(diào)HIF-1α的表達(dá)量,缺氧上調(diào)mi R-574-3p的表達(dá)可能對(duì)缺氧激活的HIF/VEGF通路有正反饋調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：缺氧 HIF-1α AGS miR-574-3p
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 緒論12-20
• 1.1 胃癌及其危害12-13
• 1.2 缺氧誘導(dǎo)因子13-16
• 1.2.1 轉(zhuǎn)錄因子13
• 1.2.2 缺氧誘導(dǎo)因子13-14
• 1.2.3 缺氧誘導(dǎo)因子的成員及結(jié)構(gòu)14
• 1.2.4 缺氧誘導(dǎo)因子的功能和作用機(jī)制14-15
• 1.2.5 缺氧誘導(dǎo)因子的臨床意義15-16
• 1.3 microRNA16-18
• 1.3.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)和命名16
• 1.3.2 miRNA的生物合成16-17
• 1.3.3 miRNA的功能及作用機(jī)制17-18
• 1.3.4 miRNA的應(yīng)用18
• 1.4 腫瘤細(xì)胞的分子調(diào)控18-20
• 第2章 HIF-1α與miRNA5743p在胃癌AGS細(xì)胞的研究20-44
• 2.1 儀器和材料20-23
• 2.1.1 主要儀器20-21
• 2.1.2 主要試劑和耗材21-23
• 2.1.3 主要試劑配制23
• 2.1.4 細(xì)胞株來(lái)源23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-32
• 2.2.1 胃癌AGS細(xì)胞培養(yǎng)23-24
• 2.2.2 光鏡下觀察AGS細(xì)胞的形態(tài)24
• 2.2.3 缺氧培養(yǎng)條件24
• 2.2.4 Western Blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)24-28
• 2.2.5 RNA提取28
• 2.2.6 RNA定量28-29
• 2.2.7 DNA&RNA轉(zhuǎn)染29
• 2.2.8 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)29-30
• 2.2.9 PCR反應(yīng)30-31
• 2.2.10 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)31
• 2.2.11 瓊脂糖凝膠電泳31
• 2.2.12 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)31
• 2.2.13 質(zhì)粒的提取31-32
• 2.3 數(shù)據(jù)處理32
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-44
• 2.4.1 CoCl_2和缺氧環(huán)境下AGS細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化32-33
• 2.4.2 CoCl_2或缺氧環(huán)境下AGS細(xì)胞HIF-1α蛋白的水平33-34
• 2.4.3 CoCl_2刺激上調(diào)AGS細(xì)胞中VEGF mRNA的表達(dá)34-35
• 2.4.4 CoCl_2或缺氧環(huán)境下AGS細(xì)胞中miR5743p的表達(dá)35-36
• 2.4.5 HIF-1α的抑制劑能夠抑制miR5743p的表達(dá)36-38
• 2.4.6 si-HIF-1α能夠抑制miR5743p的表達(dá)38-39
• 2.4.7 pcDNA3-HIF-1α(Mut)質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證39
• 2.4.8 轉(zhuǎn)染pcDNA3-HIF-1α（Mut）質(zhì)粒的蛋白表達(dá)39-40
• 2.4.9 轉(zhuǎn)染pcDNA3-HIF-1α（Mut）質(zhì)粒上調(diào)miR5743p的表達(dá)40-41
• 2.4.10 雙熒光素酶報(bào)告基因的驗(yàn)證41-42
• 2.4.11 轉(zhuǎn)染pEGFP(C1)-miR574質(zhì)粒檢測(cè)其的表達(dá)42-43
• 2.4.12 轉(zhuǎn)染pEGFP(C1)-mi R574質(zhì)粒上調(diào)HIF-1α的表達(dá)43-44
• 第3章 討論44-46
• 第4章 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-52
• 在學(xué)期間獲得的研究成果52-53
• 致謝53

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 Chao Li;Da-Ren Liu;Guo-Gang Li;Hou-Hong Wang;Xiao-Wen Li;Wei Zhang;Yu-Lian Wu;Li Chen;;CD97 promotes gastric cancer cell proliferation and invasion through exosome-mediated MAPK signaling pathway[J];World Journal of Gastroenterology;2015年20期

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本文編號(hào)：610642