本文關(guān)鍵詞：PRMT5促進(jìn)肝癌細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 蛋白質(zhì)精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5) 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) SNAIL 肝癌 增殖 遷移 侵襲

【摘要】：研究目的:本研究旨在探討蛋白質(zhì)精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶5(protein arginine methyltranserase 5,PRMT5)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響,并初步闡明其促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)作用的分子機(jī)制,為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用研究提供理論基礎(chǔ)。研究方法:Western Blot、qPCR檢測(cè)不同肝癌細(xì)胞中PRMT5蛋白質(zhì)及mRNA的表達(dá)水平;利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù),構(gòu)建PRMT5 shRNA干擾質(zhì)粒sh-PRMT5,并進(jìn)行慢病毒包裝,感染肝癌細(xì)胞,嘌呤霉素篩選得到能穩(wěn)定低表達(dá)PRMT5的肝癌細(xì)胞株,Western Blot、qPCR檢測(cè)干擾效率。將PRMT5過表達(dá)質(zhì)粒pHA-PRMT5瞬時(shí)轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株以恢復(fù)其PRMT5的表達(dá)。用CCK-8法檢測(cè)PRMT5對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響,平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRMT5對(duì)肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響,Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRMT5對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響,Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRMT5對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響,來評(píng)價(jià)PRMT5對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。Western blot檢測(cè)PRMT5對(duì)侵襲相關(guān)指標(biāo)MMP2和MMP9蛋白表達(dá)量的影響,及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)指標(biāo)E-cadherin、Collagen-I、β-catenin、α-SMA、Vimentin和SNAIL的蛋白水平的變化,免疫熒光及蛋白質(zhì)核漿分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞中SNAIL亞細(xì)胞定位的變化,初步探明PRMT5促進(jìn)EMT的分子機(jī)制。研究結(jié)果:結(jié)果表明:PRMT5特異性shRNA慢病毒載體構(gòu)建成功。肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、BEL-7402中PRMT5表達(dá)量相對(duì)較高。PRMT5特異性shRNA慢病毒載體構(gòu)建成功。慢病毒包裝并感染SMMC-7721、BEL-7402細(xì)胞株,Western blot、q PCR檢測(cè)結(jié)果表明PRMT5 shRNA慢病毒載體sh-PRMT5在肝癌細(xì)胞中具有沉默效率。靶向沉默PRMT5的表達(dá)后,肝癌細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移能力、侵襲能力減弱,MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)水平下降,E-cadherin和SNAIL蛋白表達(dá)水平增加,Collagen-I、β-catenin、α-SMA和Vimetin蛋白表達(dá)水平下降;過表達(dá)PRMT5可以部分增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移能力、侵襲能力,提高M(jìn)MP2和MMP9的蛋白表達(dá)水平和Collagen-I、β-catenin、α-SMA、Vimetin和SNAIL蛋白表達(dá)水平,降低E-cadherin蛋白表達(dá)水平。免疫熒光及蛋白質(zhì)核漿分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,靶向沉默PRMT5的表達(dá)后,肝癌細(xì)胞中SNAIL由細(xì)胞核穿梭至細(xì)胞質(zhì)中,而恢復(fù)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中PRMT5的表達(dá)后,SNAIL又重新回到細(xì)胞核中。研究結(jié)論:PRMT5促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為;其通過調(diào)控SNAIL的亞細(xì)胞定位促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
【關(guān)鍵詞】：蛋白質(zhì)精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5) 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) SNAIL 肝癌 增殖 遷移 侵襲
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 主要縮略詞表11-13
• 第一章 緒論13-19
• 1.1 研究背景13-17
• 1.1.1 肝癌13
• 1.1.2 蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 513-15
• 1.1.3 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化15-16
• 1.1.4 SNAIL16-17
• 1.2 本研究的目的、內(nèi)容、方法與技術(shù)路線17-19
• 1.2.1 研究目的17
• 1.2.2 研究?jī)?nèi)容17-18
• 1.2.3 研究技術(shù)路線圖18
• 1.2.4 研究意義18-19
• 第二章 載體構(gòu)建與鑒定、慢病毒包裝、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選19-41
• 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料19-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器19-20
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)耗材20
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑20-21
• 2.1.4 試劑配制21-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-36
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)23-25
• 2.2.2 DH5α/ Stbl3感受態(tài)細(xì)胞制備方法25-26
• 2.2.3 重組慢病毒sh-GFP及sh-PRMT5載體構(gòu)建26-30
• 2.2.4 包裝病毒30-31
• 2.2.5 感染細(xì)胞31
• 2.2.6 總RNA提取31-32
• 2.2.7 qPCR檢測(cè)方法32-33
• 2.2.8 Western Blot檢測(cè)方法33-36
• 2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法36
• 2.4 結(jié)果36-39
• 2.4.1 檢測(cè)三種不同肝癌細(xì)胞系中PRMT5的表達(dá)36
• 2.4.2 pLKO.1-TRC質(zhì)粒雙酶切36-37
• 2.4.3 菌液PCR鑒定重組質(zhì)粒sh-PRMT537
• 2.4.4 sh-PRMT5質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果37-38
• 2.4.5 檢測(cè)sh- PRMT5干擾效率38-39
• 2.5 討論39-41
• 第三章 PRMT5對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲的影響41-51
• 3.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料41-42
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器41
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)耗材41
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑41-42
• 3.1.4 試劑配制42
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法42-44
• 3.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染42
• 3.2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)42-43
• 3.2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)43
• 3.2.4 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)43
• 3.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)43-44
• 3.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)、Western blot44
• 3.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法44
• 3.4 結(jié)果44-49
• 3.4.1 CCK-8 法檢測(cè)PRMT5對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響44-45
• 3.4.2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRMT5對(duì)肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響45-46
• 3.4.3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRMT5對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響46-47
• 3.4.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRMT5對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響47-48
• 3.4.5 Western Blot檢測(cè)PRMT5對(duì)侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響48-49
• 3.5 討論49-51
• 第四章 PRMT5對(duì)肝癌細(xì)胞EMT的影響及其分子機(jī)制51-61
• 4.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料52-53
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器52
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)耗材52
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑52-53
• 4.1.4 試劑配制53
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法53-54
• 4.2.1 免疫熒光53
• 4.2.2 細(xì)胞核與細(xì)胞漿蛋白分離提取53-54
• 4.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、細(xì)胞培養(yǎng)、Western blot54
• 4.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法54
• 4.4 結(jié)果54-58
• 4.4.1 Western Blot檢測(cè)PRMT5對(duì)EMT相關(guān)蛋白的影響54-56
• 4.4.2 免疫熒光檢測(cè)PRMT5對(duì)SNAIL亞細(xì)胞定位的影響56-58
• 4.5 討論58-61
• 結(jié)論與展望61-63
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 綜述70-77
• 參考文獻(xiàn)73-77
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文77-78
• 致謝78

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7 記者 顧泳;我國(guó)肝癌患者占全球55%[N];解放日?qǐng)?bào);2010年

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