本文關(guān)鍵詞：PRMT5促進肝癌細胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及其機制研究

  更多相關(guān)文章： 蛋白質(zhì)精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5) 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) SNAIL 肝癌 增殖 遷移 侵襲

【摘要】：研究目的:本研究旨在探討蛋白質(zhì)精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶5(protein arginine methyltranserase 5,PRMT5)對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響,并初步闡明其促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)作用的分子機制,為進一步的臨床應(yīng)用研究提供理論基礎(chǔ)。研究方法:Western Blot、qPCR檢測不同肝癌細胞中PRMT5蛋白質(zhì)及mRNA的表達水平;利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù),構(gòu)建PRMT5 shRNA干擾質(zhì)粒sh-PRMT5,并進行慢病毒包裝,感染肝癌細胞,嘌呤霉素篩選得到能穩(wěn)定低表達PRMT5的肝癌細胞株,Western Blot、qPCR檢測干擾效率。將PRMT5過表達質(zhì)粒pHA-PRMT5瞬時轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株以恢復(fù)其PRMT5的表達。用CCK-8法檢測PRMT5對肝癌細胞增殖能力的影響,平板克隆形成實驗檢測PRMT5對肝癌細胞克隆形成能力的影響,Transwell遷移實驗檢測PRMT5對肝癌細胞遷移能力的影響,Transwell侵襲實驗檢測PRMT5對肝癌細胞侵襲能力的影響,來評價PRMT5對肝癌細胞生物學(xué)行為的影響。Western blot檢測PRMT5對侵襲相關(guān)指標MMP2和MMP9蛋白表達量的影響,及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)指標E-cadherin、Collagen-I、β-catenin、α-SMA、Vimentin和SNAIL的蛋白水平的變化,免疫熒光及蛋白質(zhì)核漿分離實驗檢測肝癌細胞中SNAIL亞細胞定位的變化,初步探明PRMT5促進EMT的分子機制。研究結(jié)果:結(jié)果表明:PRMT5特異性shRNA慢病毒載體構(gòu)建成功。肝癌細胞株SMMC-7721、BEL-7402中PRMT5表達量相對較高。PRMT5特異性shRNA慢病毒載體構(gòu)建成功。慢病毒包裝并感染SMMC-7721、BEL-7402細胞株,Western blot、q PCR檢測結(jié)果表明PRMT5 shRNA慢病毒載體sh-PRMT5在肝癌細胞中具有沉默效率。靶向沉默PRMT5的表達后,肝癌細胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移能力、侵襲能力減弱,MMP2和MMP9的蛋白表達水平下降,E-cadherin和SNAIL蛋白表達水平增加,Collagen-I、β-catenin、α-SMA和Vimetin蛋白表達水平下降;過表達PRMT5可以部分增強肝癌細胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移能力、侵襲能力,提高MMP2和MMP9的蛋白表達水平和Collagen-I、β-catenin、α-SMA、Vimetin和SNAIL蛋白表達水平,降低E-cadherin蛋白表達水平。免疫熒光及蛋白質(zhì)核漿分離實驗結(jié)果表明,靶向沉默PRMT5的表達后,肝癌細胞中SNAIL由細胞核穿梭至細胞質(zhì)中,而恢復(fù)穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞中PRMT5的表達后,SNAIL又重新回到細胞核中。研究結(jié)論:PRMT5促進了肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為;其通過調(diào)控SNAIL的亞細胞定位促進了肝癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
【關(guān)鍵詞】：蛋白質(zhì)精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5) 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) SNAIL 肝癌 增殖 遷移 侵襲
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 主要縮略詞表11-13
• 第一章 緒論13-19
• 1.1 研究背景13-17
• 1.1.1 肝癌13
• 1.1.2 蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 513-15
• 1.1.3 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化15-16
• 1.1.4 SNAIL16-17
• 1.2 本研究的目的、內(nèi)容、方法與技術(shù)路線17-19
• 1.2.1 研究目的17
• 1.2.2 研究內(nèi)容17-18
• 1.2.3 研究技術(shù)路線圖18
• 1.2.4 研究意義18-19
• 第二章 載體構(gòu)建與鑒定、慢病毒包裝、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株篩選19-41
• 2.1 實驗儀器和材料19-23
• 2.1.1 實驗儀器19-20
• 2.1.2 實驗耗材20
• 2.1.3 實驗試劑20-21
• 2.1.4 試劑配制21-23
• 2.2 實驗方法23-36
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)23-25
• 2.2.2 DH5α/ Stbl3感受態(tài)細胞制備方法25-26
• 2.2.3 重組慢病毒sh-GFP及sh-PRMT5載體構(gòu)建26-30
• 2.2.4 包裝病毒30-31
• 2.2.5 感染細胞31
• 2.2.6 總RNA提取31-32
• 2.2.7 qPCR檢測方法32-33
• 2.2.8 Western Blot檢測方法33-36
• 2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法36
• 2.4 結(jié)果36-39
• 2.4.1 檢測三種不同肝癌細胞系中PRMT5的表達36
• 2.4.2 pLKO.1-TRC質(zhì)粒雙酶切36-37
• 2.4.3 菌液PCR鑒定重組質(zhì)粒sh-PRMT537
• 2.4.4 sh-PRMT5質(zhì)粒測序結(jié)果37-38
• 2.4.5 檢測sh- PRMT5干擾效率38-39
• 2.5 討論39-41
• 第三章 PRMT5對肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲的影響41-51
• 3.1 實驗儀器和材料41-42
• 3.1.1 實驗儀器41
• 3.1.2 實驗耗材41
• 3.1.3 實驗試劑41-42
• 3.1.4 試劑配制42
• 3.2 實驗方法42-44
• 3.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染42
• 3.2.2 CCK-8 實驗42-43
• 3.2.3 平板克隆形成實驗43
• 3.2.4 Transwell遷移實驗43
• 3.2.5 Transwell侵襲實驗43-44
• 3.2.6 細胞培養(yǎng)、Western blot44
• 3.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法44
• 3.4 結(jié)果44-49
• 3.4.1 CCK-8 法檢測PRMT5對肝癌細胞增殖能力的影響44-45
• 3.4.2 平板克隆形成實驗檢測PRMT5對肝癌細胞克隆形成能力的影響45-46
• 3.4.3 Transwell遷移實驗檢測PRMT5對肝癌細胞遷移能力的影響46-47
• 3.4.4 Transwell侵襲實驗檢測PRMT5對肝癌細胞侵襲能力的影響47-48
• 3.4.5 Western Blot檢測PRMT5對侵襲相關(guān)蛋白表達的影響48-49
• 3.5 討論49-51
• 第四章 PRMT5對肝癌細胞EMT的影響及其分子機制51-61
• 4.1 實驗儀器和材料52-53
• 4.1.1 實驗儀器52
• 4.1.2 實驗耗材52
• 4.1.3 實驗試劑52-53
• 4.1.4 試劑配制53
• 4.2 實驗方法53-54
• 4.2.1 免疫熒光53
• 4.2.2 細胞核與細胞漿蛋白分離提取53-54
• 4.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、細胞培養(yǎng)、Western blot54
• 4.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法54
• 4.4 結(jié)果54-58
• 4.4.1 Western Blot檢測PRMT5對EMT相關(guān)蛋白的影響54-56
• 4.4.2 免疫熒光檢測PRMT5對SNAIL亞細胞定位的影響56-58
• 4.5 討論58-61
• 結(jié)論與展望61-63
• 參考文獻63-70
• 綜述70-77
• 參考文獻73-77
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文77-78
• 致謝78

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1 吳孟超;;肝癌外科治療的近期進展[J];中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志;2006年02期

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3 徐連根;周晶;雷偉;沈志祥;;瘦素及其受體在肝癌組織中的表達及意義[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2006年05期

4 魏麗珍;李勝棉;張楠;溫登瑰;周燁;王士杰;;688例肝癌患者發(fā)病特點及診療狀況分析[J];肝臟;2010年02期

5 ;我國科研人員發(fā)現(xiàn)促進肝癌生長和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因[J];臨床薈萃;2010年10期

6 吳生;;盤點誘發(fā)肝癌的7大元兇[J];肝博士;2012年01期

7 鄧慶華;一家四例肝癌報道[J];中國廠礦醫(yī)學(xué);1995年06期

8 王定珠;;觥籌交錯 過度疲勞 肝癌乘機而入[J];健康博覽;2005年11期

9 笑山,吳蓉蓉;喝咖啡可以減少肝癌發(fā)生率[J];健康之路;2005年04期

10 ;遠離肝癌 預(yù)防在先[J];農(nóng)民文摘;2006年02期

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1 俞順章;穆麗娜;;飲水中藻類毒素與肝癌關(guān)系和控制的研究(摘要)[A];全國腫瘤流行病學(xué)和腫瘤病因?qū)W學(xué)術(shù)會議論文集[C];2007年

2 楊秉輝;;肝癌預(yù)防的新話題-非酒精性脂肪性肝病與肝癌[A];第十二屆全國肝癌學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

3 丁光偉;楊玉秀;徐秋霞;徐存拴;;肝癌多基因表達異常初步研究[A];第五屆全國肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

4 吳孟超;;肝癌外科治療的近期進展[A];第三屆全國重型肝病及人工肝血液凈化學(xué)術(shù)年會論文集（上冊）[C];2007年

5 劉耕陶;孫華北;方亞南;;肝癌發(fā)生的化學(xué)預(yù)防[A];第十次中國生物物理學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2006年

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8 呂巖;韓學(xué)鋒;;肝癌患者需求的評估[A];中華醫(yī)學(xué)會醫(yī)學(xué)工程學(xué)分會第八次學(xué)術(shù)年會暨《醫(yī)療設(shè)備信息》創(chuàng)刊20周年慶祝會論文集[C];2006年

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10 謝靜媛;戴煒;涂愛民;趙文高;符花;胡應(yīng)龍;;深圳地區(qū)53例肝癌發(fā)生的相關(guān)因素探討[A];全國第2屆中西醫(yī)結(jié)合傳染病學(xué)術(shù)會議暨國家中醫(yī)藥管理局第1屆傳染病協(xié)作組會議論文匯編[C];2008年

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1 湖北宜昌 胡獻國;吸煙與肝癌[N];上海中醫(yī)藥報;2013年

2 四川成都 孫清廉;遠離肝癌 謹防四大危險因素[N];上海中醫(yī)藥報;2013年

3 特約撰稿 北京朝陽醫(yī)院京西院區(qū)肝膽外科主任 孫文兵;警惕肝癌的過度治療[N];醫(yī)藥導(dǎo)報;2007年

4 健康時報特約記者 孫理;三招不得肝癌[N];健康時報;2008年

5 葉建平;專家提醒肝癌患者保護生命 重在“三早”防治[N];中國中醫(yī)藥報;2008年

6 通訊員 韋夏 本報記者 鄧宏鷹 鐘少鴻;不良飲食習(xí)慣易誘發(fā)肝癌[N];中國食品報;2009年

7 記者 顧泳;我國肝癌患者占全球55%[N];解放日報;2010年

8 解放軍302醫(yī)院 劉士敬;四成肝癌酒精泡出來的[N];健康時報;2010年

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10 記者 胡德榮;肝癌發(fā)生早期階段分子機制被揭示[N];健康報;2012年

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1 陳放;TOPK蛋白和肝癌發(fā)生以及相關(guān)調(diào)控機制的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

2 張怡安;中樞神經(jīng)特異性RNA結(jié)合蛋白NOVA1在肝癌中的表達及其促進腫瘤發(fā)展的潛在分子機制探究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

3 殷杰;E3泛素連接酶Prp19對肝癌侵襲的影響及其機制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

4 周宇紅;分化抑制因子ID1在調(diào)控化療誘導(dǎo)的肝癌細胞“干性”改變中的作用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

5 王盛;FOXA1基因變異和調(diào)控異常促，

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