本文關(guān)鍵詞：miR20a和miR20b對(duì)FIP200的調(diào)控及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞自噬的作用研究

  更多相關(guān)文章： microRNA FIP200 細(xì)胞自噬 乳腺癌 基因表達(dá)調(diào)控 生物信息學(xué)

【摘要】：目的：細(xì)胞自噬(Autophagy)是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象,是高度保守的自我消化過程,在維持正常細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的平衡中發(fā)揮著重要的作用。FIP200(focal adhesion kinase family interacting protein of 200kD),是分子量大小為200kD的黏著斑激酶家族相互作用蛋白。FIP200是細(xì)胞自噬起始復(fù)合蛋白中的一個(gè)重要調(diào)控蛋白。ULK1-Atg13-FIP200復(fù)合體在細(xì)胞自噬起始過程中起著重要作用。microRNA是一類高度保守、長度很短的非編碼調(diào)控單鏈RNA,約18-24個(gè)核苷酸,通過與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)配對(duì)導(dǎo)致mRNA降解或抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯誘導(dǎo)基因沉默。miRNA參與生命活動(dòng)中多步重要進(jìn)程,包括發(fā)育、分化、器官形成、衰老、凋亡、增殖、和癌癥的發(fā)生發(fā)展。目前,尚未有研究報(bào)道m(xù)icroRNA對(duì)FIP200的作用,本課題研究通過篩選靶向于FIP200的mircoRNA,并探討后者與乳腺癌細(xì)胞自噬的作用,闡明乳腺癌細(xì)胞中miRNA 與 FIP200的關(guān)系。方法：(1)篩選和鑒定直接調(diào)控FIP200表達(dá)的miRNA:為篩選出靶向于FIP200的microRNAs，本項(xiàng)目采用生物信息學(xué)軟件,分別有TargetScan、PicTar 和 miRanda,根據(jù)多個(gè)軟件預(yù)測出靶向于FIP200的microRNAs,選出共同預(yù)測到的10個(gè)nicroRNAs;采用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體分別構(gòu)建以上10個(gè)microRNAs,采用siCHECKTM-2 dual luciferase reporter plasmi d載體構(gòu)建FIP200 3'UTR和FIP200 3'UTR Mutant表達(dá)載體,將FIP200-3'UTR 和 microRNA表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF7、MDB-MA-231,肺癌細(xì)胞A549,宮頸癌細(xì)胞Hela,肝癌細(xì)胞HepG2,通過雙螢光報(bào)告系統(tǒng)在不同細(xì)胞中隨機(jī)驗(yàn)證篩選出下調(diào)FIP200的microRNAs共3個(gè)miR20a、miR20b和niR302a,進(jìn)一步Western結(jié)果顯示過表達(dá)這些miRNA可以顯著降低FIP200蛋白表達(dá)的有兩個(gè)：miR20a和niR20b。(2)進(jìn)一步確認(rèn)篩選出的miRNAs對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控：microRNAs的過表達(dá),驗(yàn)證FIP200的下調(diào)是否會(huì)抑制細(xì)胞自噬水平,本研究建立雷帕霉素(Rapamycin)誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬模型,通過以下三種方法：Westemblotting檢測細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)水平,激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞自噬小體熒光顆粒的聚集,透射電鏡觀察自噬小體的結(jié)構(gòu)：siRNA干擾FIP200的表達(dá),驗(yàn)證microRNAs對(duì)細(xì)胞自噬的下調(diào)是否通過下調(diào)FIP200的表達(dá)來完成。(3)研究在乳腺癌細(xì)胞中micro RNA與FIP200的關(guān)系：為了驗(yàn)證我們的結(jié)論,我們分別檢測了乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺細(xì)胞中內(nèi)源性miR20a、miR20b和FIP200的表達(dá)水平。確認(rèn)在細(xì)胞內(nèi)miR20a以及miR20b與FIP200的關(guān)系。結(jié)果：生物信息學(xué)軟件分析說明FIP200 3'UTR有多個(gè)microRNAs的種子序列能與其結(jié)合。我們選取多個(gè)軟件共同預(yù)測到的并且種子序列與靶基因完全配對(duì)的10個(gè)microRNAs,分別為miR20a、miR20b、miR106b、miR133a、miR133b、miR302a、miR302b、 miR302c、 miR302d和miR372,在多個(gè)細(xì)胞系中隨機(jī)驗(yàn)證,通過雙熒光報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示miR20a、miR20b、miR106b、miR302a、miR302b、miR302c、miR302d能抑制FIP200的表達(dá)。Western blotting結(jié)果顯示,在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)以上miRNAs,其中miR20a和miR20b能顯著抑制FIP200蛋白的水平。我們的結(jié)果證明1niR20a和miR20b能調(diào)控FIP200的蛋白表達(dá),進(jìn)一步在細(xì)胞自噬模型中通過Western檢測細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3、激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞自噬小體熒光顆粒的聚集、透射電鏡觀察自噬小體的結(jié)構(gòu),驗(yàn)證了miR20a和miR20b能通過靶向于FIP200抑制細(xì)胞自噬水平。此外,我們檢測了人類正常乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中miR20a和miR20b的內(nèi)源性表達(dá)水平,real time PCR結(jié)果顯示,miR20a和miR20b在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于正常細(xì)胞中的表達(dá)水平,Western結(jié)果顯示FIP200在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)。這為我們通過miR20a和miR20b來治療乳腺癌提供了新的思路。結(jié)論：(1)miR20a和miR20b能夠抑制靶基因FIP200的表達(dá)。(2)miR20a和miR20b能抑制乳腺癌細(xì)胞中的細(xì)胞自噬水平。(3)miR20a和miR20b在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)。(4)FIP200在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：microRNA FIP200 細(xì)胞自噬 乳腺癌 基因表達(dá)調(diào)控 生物信息學(xué)
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 緒言10-11
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述11-27
• 一、細(xì)胞自噬的研究進(jìn)展11-18
• 二、FIP200的研究進(jìn)展18-19
• 三、microRNA的研究進(jìn)展19-24
• 四、腫瘤的研究進(jìn)展24-27
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)材料與方法27-48
• 一、實(shí)驗(yàn)材料與儀器27-32
• 二、實(shí)驗(yàn)方法32-48
• 第三部分 結(jié)果與討論48-70
• 第一章 靶向FIP200的miRNAs的篩選與鑒定48-59
• 第一節(jié) fip200的相關(guān)分析48
• 第二節(jié) 生物信息學(xué)預(yù)測48-50
• 第三節(jié) 細(xì)胞水平篩選實(shí)驗(yàn)50-57
• 討論57-59
• 第二章 miR20a和miR20b在細(xì)胞自噬中的作用59-67
• 第一節(jié) 細(xì)胞自噬模型的建立59-60
• 第二節(jié) miR20a和miR20b對(duì)細(xì)胞自噬水平的調(diào)控60-66
• 討論66-67
• 第三章 乳腺癌細(xì)胞中miR20a,miR20b和FIP200的關(guān)系67-70
• 第一節(jié) 細(xì)胞內(nèi)源性miR20a和miR20b的表達(dá)水平67-68
• 第二節(jié) 細(xì)胞內(nèi)源性FIP200的表達(dá)水平68-69
• 討論69-70
• 結(jié)論70-71
• 參考文獻(xiàn)71-77
• 致謝77-78
• 作者簡介78

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 邢國勝;賀桂泉;趙文君;;藥物對(duì)細(xì)胞自噬性死亡的干預(yù)作用[J];天津藥學(xué);2011年03期

2 ;《現(xiàn)代細(xì)胞自噬分子生物學(xué)》出版[J];診斷學(xué)理論與實(shí)踐;2011年05期

3 ;《現(xiàn)代細(xì)胞自噬分子生物學(xué)》出版[J];診斷學(xué)理論與實(shí)踐;2011年06期

4 陳蘭芳;肖亮;楊軍平;;細(xì)胞自噬的分子機(jī)制及其功能[J];實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué);2014年02期

5 李桂蘭;閆華超;;細(xì)胞自噬對(duì)衰老的調(diào)節(jié)[J];中國老年學(xué)雜志;2010年09期

6 王琦;蘇舒;王立新;;胞內(nèi)感染病原體與細(xì)胞自噬相互作用的研究進(jìn)展[J];東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年03期

7 ;《自然-細(xì)胞生物學(xué)》:蛋白抗癌與其誘導(dǎo)細(xì)胞自噬有關(guān)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年20期

8 汪昌麗;滿娜;溫龍平;;納米材料誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的效應(yīng)及生物學(xué)功能[J];東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年01期

9 錢帥偉;漆正堂;支彩霞;丁樹哲;;抑癌基因p53與細(xì)胞自噬[J];生命的化學(xué);2011年05期

10 馬泰;孫國平;李家斌;;細(xì)胞自噬的研究方法[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2012年03期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 許赤;陳文捷;楊楊;李華;易述紅;陳規(guī)劃;;老年大鼠肝臟細(xì)胞自噬及其移植后改變[A];2013中國器官移植大會(huì)論文匯編[C];2013年

2 劉杰民;紀(jì)云西;蔣歷;黃貴華;鄭超偉;郭超峰;;細(xì)胞自噬是探索中醫(yī)藥微觀機(jī)制的新思路[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)第二十四次全國脾胃病學(xué)術(shù)交流會(huì)論文匯編[C];2012年

3 李康生;代劍平;;病毒感染與細(xì)胞自噬[A];新發(fā)和再發(fā)傳染病防治熱點(diǎn)研討會(huì)論文集[C];2011年

4 楊鍵;鄧玉杰;張曉燕;呂鵬飛;徐俊;楊穎;寧光;;脂肪細(xì)胞自噬檢測方法的建立及意義探討[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十一次全國內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

5 陳英;樸英杰;;人肝細(xì)胞自噬性凋亡的形態(tài)學(xué)觀察[A];第十二屆全國電子顯微學(xué)會(huì)議論文集[C];2002年

6 楊鍵;鄧玉杰;張曉燕;呂鵬飛;徐俊;楊穎;寧光;;脂肪細(xì)胞自噬檢測方法的建立及意義探討[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)第十六次全國學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2012年

7 趙穎;楊靜;廖文娟;劉向宇;張輝;王杉;王冬來;馮京南;俞立;朱衛(wèi)國;;胞漿中Fox01引起細(xì)胞自噬進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤的功能[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)分會(huì)第七屆全國中青年腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議——中華醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)分會(huì)“中華腫瘤 明日之星”大型評(píng)選活動(dòng)暨中青年委員全國遴選論文匯編[C];2011年

8 陳永;鄒s舠，

本文編號(hào)：550027