發(fā)布時間：2017-07-15 15:13

  本文關(guān)鍵詞：伊曲康唑聯(lián)合蒽環(huán)類藥物對白血病干細胞樣細胞KG1α的生物學(xué)效應(yīng)及作用機制的研究

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【摘要】：研究背景急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一類起源于造血干、祖細胞的髓系造血系統(tǒng)惡性腫瘤。AML隨著新藥的不斷研發(fā)以及造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplntation,HSCT)的應(yīng)用,AML的治療效果取得了突破性的進展,當(dāng)前治療AML的主要方法是聯(lián)合化療以及緩解后的造血干細胞移植。早期大劑量的聯(lián)合化療雖然能使許多患者達到完全緩解(Complete remission,CR),但是伴隨有嚴(yán)重的副作用,老年患者不能耐受,容易復(fù)發(fā)。隨著大劑量聯(lián)合化療、免疫抑制劑及造血干細胞移植的應(yīng)用,侵襲性真菌感(invasive fungal infection,IFI)染逐年增多,成為AML患者的死亡原因之一。越來越多的證據(jù)支持這一觀念,AML需建立分層體系,是源于體內(nèi)存在的一定比例的白血病干細胞(leukemia stem cells,LSCs)。與正常的造血干細胞相似,LSCs也具有自我更新能力,并能使外周血和骨髓中的白血病細胞大量生長和增殖。研究認(rèn)為,AML患者體內(nèi)的LSCs導(dǎo)致了治療的失敗和AML的復(fù)發(fā),這是由于LSCs抵抗化療。因此,在進一步改善傳統(tǒng)放、化療,以期通過小劑量藥物聯(lián)合作用提高LSCs對藥物的敏感性,達到低毒高效的目的,為血液病新治療方案的研究領(lǐng)域提供越來越多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。Hedgehog (Hh)信號通路是生物進化史上最為保守的信號途徑之一。Hedgehog基因有3種同源基因：Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh),分別編碼Shh、Ihh和Dhh蛋白[4]。Hh信號通路包含Patched (Ptc)、 Smoothened (Smo)和通路下游的轉(zhuǎn)錄因子Ci/Gli、絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶Fused (Fu)、Fu抑制劑(SuFu)、類運動蛋白Costal-2(Cos-2)、蛋白激酶A (PKA)等多種蛋白。在正常情況下(無Hh), Ptc抑制Smo的活性,同時全長的Ci/Gli會被PKA、GSK3及CKI磷酸化,并降解為片段化的Ci75,進入細胞核內(nèi),抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。而在有Hh的情況下,Hh與Ptc結(jié)合后,解除Ptc對Smo的抑制,導(dǎo)致Smo被PKA、CKI磷酸化并在膜上聚積,同時Smo分子的C-末端發(fā)生構(gòu)象改變,由閉合的無活性的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放的有活性的狀態(tài),進而激活下游通路。它是調(diào)控胚胎發(fā)育、組織的形成和造血功能的關(guān)鍵因素。它可影響干細胞,組織細胞的分化、增殖和凋亡。在成人體內(nèi),Hh信號通路的活躍對于組織修復(fù)與再生是必要的。主要是由于Hh通路下游Gli1轉(zhuǎn)錄激活因子可以誘導(dǎo)G1/S細胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達而促進細胞的增殖；也可以直接誘導(dǎo)抗凋亡因子Bcl-2表達以抑制凋亡；還可直接激活可促進上皮組織向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的因子的轉(zhuǎn)錄以提高腫瘤的侵襲性。因此,Hedgehog信號通路的紊亂與惡性腫瘤的形成、生長和維持有關(guān)如黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌、腸癌、乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤等。一些血液系統(tǒng)腫瘤如急性白血病(AML、ALL)、慢性粒細胞性白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)、CLL、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤(MM)均是依賴Hedgehog信號通路。近年來有許多研究顯示Hh信號通路對于惡性腫瘤干細胞的維持和擴散起著非常重要的作用。Zhao等認(rèn)為Smo的活化對鼠和人CML干細胞數(shù)量的維持是必須的,Smo能增加CML干細胞的數(shù)量并使病情惡化,而Smo的缺失則可能是干細胞耗盡。這提示針對Smo的抑制劑可能有效的減少白血病干細胞,從而成為一種有效的治療手段。伊曲康唑(Itraconazole, ITC)是一種抗真菌藥,伊曲康唑作為惡性血液病IFI一線預(yù)防治療藥物,通過抑制真菌的固醇生物合成而起作用,其主要機制也同樣抑制了Hedgehog信號通路。研究發(fā)現(xiàn),在鼠髓母細胞瘤同種移植腫瘤和抗真菌治療的患者的血清中,伊曲康唑能顯著抑制Hedgehog信號通路的活性,阻止腫瘤的生長。與三氧化二砷聯(lián)合使用,可協(xié)同抑制Hh信號通路。有報道說,伊曲康唑能抑制非小細胞肺癌血管及腫瘤細胞的生長。還有臨床研究表明[32],伊曲康唑可用于治療復(fù)發(fā)性前列腺癌,并取得較好的效果。因此,對于依賴Hh信號通路的腫瘤,單用伊曲康唑或者聯(lián)合其他化療藥物用于抗腫瘤的治療將會有良好的應(yīng)用前景。蒽環(huán)類藥物(Anthracyclines)是臨床上的常用的一類化療藥,可抑制RNA和DNA的合成,抗瘤譜較廣,對多種腫瘤均有作用,屬周期非特異性藥物,對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用,主要適用于急性白血病、乳腺癌、肺癌等。然而,蒽環(huán)類藥物有較大的毒副作用如心臟毒性,并且現(xiàn)在出現(xiàn)了白血病細胞對蒽環(huán)類藥物耐藥。目前尚未有蒽環(huán)類藥物與伊曲康唑聯(lián)合應(yīng)用于急性白血病的報道。本實驗用KGla細胞作為實驗對象,KGla細胞株源于男性AML患者,不能分化,且具有自我更新潛能并具有化療治療抵抗性(耐蒽環(huán)類藥物),可認(rèn)為KG1α細胞是“白血病干細胞樣細胞”。為探討Hedgehog信號通路是否作為新靶向應(yīng)用于白血病的治療,以及聯(lián)合抑制Hh通路和RNA、DNA合成是否對白血病細胞表現(xiàn)出協(xié)同殺傷作用及其機制。本課題,擬采取形態(tài)學(xué)、分子和細胞生物學(xué)等方法系統(tǒng)研究蒽環(huán)類化療藥聯(lián)合Hh抑制劑伊曲康唑?qū)毙运柘导毎闗G1a細胞的生物學(xué)效應(yīng)及可能的分子機理,從而有望為這一靶向于白血病干細胞的低毒高效的新方法應(yīng)用于白血病防治提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。第一章 伊曲康唑聯(lián)合蒽環(huán)類藥物對白血病干細胞樣細胞KG1α生物學(xué)效應(yīng)目的研究伊曲康唑(ITC)單藥及聯(lián)合化療藥阿霉素(Adriamycin,ADM)或柔紅霉素(Daunorubicin,DNR)對KG1α細胞增殖及凋亡的影響。方法流式細胞儀檢測KG1αt細胞表面CD34和CD38抗原的表達；活細胞計數(shù)試劑盒(CCK8)法檢測不同濃度ITC、ADM、DNR單藥及ITC (2、6、15μmol/L)聯(lián)合ADM(0.30、0.75μmol/L)或DNR(0.6、1.5μmol/L)對人急性髓系白血病細胞株KGla的增殖抑制作用；不同濃度ITC持續(xù)處理的KG1α細胞,分別于7、14、21 d觀察對集落克隆形成的影響；ADM 0.75μmol/L或DNR1.5μmol/L、ITCμmol/L及二者聯(lián)合作用KG1α細胞48 h后,瑞氏染色法觀察細胞形態(tài)變化,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率、線粒體膜電位及細胞周期阻滯情況。統(tǒng)計學(xué)方法所有實驗均重復(fù)3次后,數(shù)據(jù)以量x±s表示,應(yīng)用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù),多組間均數(shù)比較采用單因設(shè)計資料的方差分析,兩組均數(shù)比較采用t檢驗,以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果KG1α細胞中有CD34+CD38-細胞約96.23%。ITC、ADM及DNR對KG1α細胞具有增殖抑制作用,并且ITC可降低KG1α克隆形成能力,呈劑量依賴。Weeb系數(shù)檢驗,ADM 0.75μmol/L或DNR 1.5μmol/L與ITC 6μmol/L兩藥聯(lián)合時,細胞實際存活率夕0%細胞預(yù)估存活率,有協(xié)同效應(yīng)；聯(lián)合組與對照組和單藥組相比,KGla細胞形態(tài)變化更為明顯。ADM 0.75μmol/L與ITC 6μmol/L聯(lián)合誘導(dǎo)KGla細胞48 h的凋亡率為31.72%±1.58%,均顯著高于對照組、ITC單藥組和ADM單藥組(4.17%±0.74%、4.33%±1.12%、9.53%±1.15%,均P0.01); DNR 1.5μmol/L與ITC 6μmol/L聯(lián)合誘導(dǎo)KGl α細胞48 h的凋亡率為32.13%±4.11%,均顯著高于對照組、ITC單藥組和DNR單藥組(3.61%±1.94%、3.52%±1.92%、10.70%±2.15%,均P0.01)。線粒體膜電位檢測中,ADM+ITC組的低紅色熒光細胞(P3)比例明顯高于對照組、ADM和ITC單藥組(18.82%±3.96%比5.02%±2.11%、9.7%±1.56%、7.1%±2.82%,均P0.01);DNR+ITC組P3區(qū)比例也顯著的高于對照組和DNR, ITC組(30.84%±4.01%比10.51%±1.97%、9.53%±3.12%、7.0%±1.33%,均P0.01)。ADM 0.75μmol/L或DNR1.5μmol/L與ITC 6μmol/L聯(lián)合組與對照組及單藥組比明顯阻滯細胞于G2期(P0.05)。結(jié)論1.KG1α細胞大部分細胞具有干性,可作為本實驗的LSCs模型；2. ITC、 ADM、 DNR單藥在一定范圍內(nèi)可以抑制細胞的增殖,并時間和劑量的依賴；ITC可以抑制不同階段KG1α細胞集落的形成,呈劑量依賴；3.ITC與ADM或DNR合用可明顯抑制細胞的增殖,且呈時間和劑量的依賴性；4.ITC聯(lián)合ADM或DNR后與單藥相比增加了KG1α細胞的凋亡率、線粒體的損傷及細胞G2期的阻滯作用。第二章 伊曲康唑聯(lián)合柔紅霉素誘導(dǎo)白血病干細胞樣細胞KG1α凋亡機制的研究目的研究伊曲康唑聯(lián)合化療藥柔紅霉素(Daunorubicin, DNR)對急性髓系白血病細胞凋亡的影響及可能的分子機制。方法用蛋白芯片檢測各藥物處理組凋亡相關(guān)蛋白的表達情況。Western印跡檢測Sonic Hedgehog(Shh)信號通路相關(guān)蛋白Shh和膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同系物1(Gli1)的表達水平,及凋亡關(guān)蛋白Bcl-2、XIAP、SMAC的表達水平。用流式細胞術(shù)和westernblot的方法分別檢測ABT-199處理DNR+ITC作用KGla細胞后存活的細胞凋亡情況及Bcl-2的表達情況。統(tǒng)計學(xué)方法所有實驗均重復(fù)3次后,數(shù)據(jù)以x±s表示,應(yīng)用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù),多組間均數(shù)比較采用單因設(shè)計資料的方差分析,兩組均數(shù)比較采用t檢驗,以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果從蛋白芯片的結(jié)果可以看出,Survivin、HSP60、SMAC、HTRA、Bcl-2、p21、Fas等蛋白表達水平與單藥和對照組相比均有不同程度的升高；而XIAP、CD40L、 CD40、bax等的表達與對照和單藥相比均有不同程度的降低。Western印跡結(jié)果顯示ITC與DNR可使Shh和Gli1的表達水平明顯下降,并且下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、XIAP、SMAC的表達。結(jié)論1、ITC可以抑制Shh信號通路,與DNR聯(lián)合后可明顯的抑制Shh信號通路,以及改變凋亡相關(guān)蛋白表達。2、Bcl-2抑制劑ABT-199可誘導(dǎo)DNR+ITC聯(lián)合作用于KGla細胞后存活的細胞凋亡,并明顯的下調(diào)存活細胞Bcl-2表達。
【關(guān)鍵詞】：伊曲康唑 蒽環(huán)類藥物 急性髓系白血病細胞 細胞凋亡 伊曲康唑 柔紅霉素 KG1α細胞 細胞凋亡 Hedgehog 信號通路 Bcl-2
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.7
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-25
• 第一章 伊曲康唑聯(lián)合蒽環(huán)類藥對白血病干細胞樣細胞KG1α增殖、凋亡的影響25-45
• 1 材料與方法26-31
• 2 結(jié)果31-42
• 3 討論42-45
• 第二章 伊曲康唑聯(lián)合柔紅霉素誘導(dǎo)白血病干細胞樣細胞KG1α凋亡機制的研究45-56
• 1 材料與方法45-49
• 2 結(jié)果49-54
• 3 討論54-56
• 全文小結(jié)56-57
• 參考文獻57-62
• 縮略詞中英文對照表62-63
• 攻讀學(xué)位期間成果63-64
• 致謝64-65

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1 王靜;伊曲康唑聯(lián)合蒽環(huán)類藥物對白血病干細胞樣細胞KG1α的生物學(xué)效應(yīng)及作用機制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

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本文編號：544483