本文關鍵詞：SEPP1高甲基化在VHL野生型腎透明細胞癌發(fā)生中的作用和機制研究

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【摘要】：目的：1.利用基因芯片技術篩選出在VHL野生型和VHL突變型的腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)中甲基化程度及表達程度均有差異的基因,在ccRCC原代培養(yǎng)細胞及腫瘤組織中對差異進行驗證。2.構建目的基因表達載體及穩(wěn)轉細胞株,通過一系列功能試驗研究目的基因在ccRCC的發(fā)生中發(fā)揮的功能,對VHL野生型腎透明細胞癌的發(fā)生機制進行補充。方法：1.對ccRCC的新鮮腫瘤組織進行細胞傳代培養(yǎng),在得到的穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的腫瘤細胞株中(均進行過str鑒定)根據患者性別、年齡、腫瘤的Fur man分級、腫瘤直徑進行配對分組，篩選出5例VHL突變及5例VHL野生型的ccRCC.提取這10個ccRCC的總RNA，，進行Affymetrix HTA2.0表達譜芯片檢測;提取這10個ccRCC的總DNA,進行Illumina 450K甲基化芯片檢測。2.提取20例VHL突變和20例VHL野生型的原代培養(yǎng)細胞的總RNA,逆轉成cDNA,利用RT-PCR的方法驗證表達譜芯片結果。3.提取20例VHL突變和20例VHL野生型的原代培養(yǎng)細胞的總DNA并進行硫化,利用甲基化特異性PCR的方法驗證甲基化芯片結果。4.使用Sequenom MassArray甲基化檢測方法檢測目標基因CpG島甲基化程度。5.使用Western-blot及免疫組化方法檢測目標基因SEPP1在VHL突變和VHL野生型ccRCC組織中的表達情況。6.以人胚腎細胞株293T細胞的cDNA作為模板,通過PCR方法獲得人SEPP1全長序列片段,并與慢病毒表達載體plv-EGFP(2A) Puro質粒相連接,獲得重組plv-EGFP(2A)Puro-SEPP1載體并進行基因測序驗證。將重組慢病毒載體與包裝質粒共同轉染293T細胞,進行病毒包裝。用病毒上清感染腎透明細胞癌細胞株786-O和769-P,得到穩(wěn)轉細胞株。7.使用Western blot方法檢測SEPP1蛋白表達情況。按照重組慢病毒載體感染細胞株、空載體感染細胞株、未經感染細胞株進行分組,并通過MTS檢測法、細胞平板克隆形成實驗、細胞周期試驗對細胞的增殖能力進行評估。結果：1.表達譜芯片中篩選出80個差異倍數大于1.5且P0.05的編碼基因,在其中篩選出12個改變倍數2的編碼基因并利用RT-PCR在原代培養(yǎng)細胞中進行驗證，結合文獻報道及基因已知的功能,選擇SLC34A2, CXCL5, SULT1C4, AKAP12, SEPP1進行驗證。2.從甲基化芯片中選擇甲基化改變明顯且在表達譜芯片中存在差異的四個基因：SLUT1C4,SEPP1、SLC34A2和AKAP12,利用MSP 和 Sequenom MassARRAY甲基化檢測，其中SEPP1在VHL突變型和VHL野生型ccRCC中的甲基化差異得到驗證。3.利用western-blot和免疫組化方法,SEPPI的表達差異在組織中得到驗證。4plv-EGFP(2A)Puro-SEPP1重組慢病毒表達載體構建成功,經其感染的786-O、769-P細胞株在轉染48h后在熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達顯著，SEPP1 蛋白表達水平均明顯提高。5.MTS實驗結果提示plv-EGFP(2A)Puro-SEP P1感染組的細胞增殖能力降低(P0.01)。6.平板克隆形成實驗結果顯示,SEPPI過表達細胞系集落形成能力明顯降低(P0.001)。7.周期試驗提示SEPP1過表達引起腎癌細胞G2/M期阻滯。結論：1、利用芯片技術及多個驗證試驗篩選出在VHL突變型和VHL野生型ccRCC中甲基化水平和表達水平均存在差異的基因SEPP1。2、成功構建重組慢病毒表達載體plv-EGFP(2A)Puro-SEPP1,在786-O、769-P細胞株中過表達的SEPP1可引起細胞周期G2/M期阻滯,并顯著降低細胞增殖能力。
【關鍵詞】：腎透明細胞癌 DNA甲基化 VHL基因 Affymetrix HTA2.0表達譜芯片 Illumina 450K甲基化芯片 SEPP1基因 硒蛋白P 慢病毒表達載體 腫瘤增殖
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 第一部分 VHL野生型與VHL突變型腎透明細胞癌中差異表達基因的篩選髓證及甲基化水平檢測12-36
• 1. 材料與方法12-28
• 2. 結果28-35
• 3. 小結35-36
• 第二部分 SEPP1基因慢病毒過表達載體構建及其在腎透明細胞癌細胞中的功能研究36-45
• 1. 材料與方法36-40
• 2. 結果40-44
• 3. 小結44-45
• 討論及結論45-48
• 參考文獻48-51
• 綜述：DNA甲基化在腎癌發(fā)生、診斷和治療中的作用及前景51-63
• 參考文獻56-63
• 英文縮略詞表63-64
• 攻讀學位期間發(fā)表論文64-65
• 致謝65-66

本文編號：528444