葫蘆素B對于結腸癌細胞生長與增殖抑制作用的研究

發(fā)布時間：2017-07-03 08:22

本文關鍵詞：葫蘆素B對于結腸癌細胞生長與增殖抑制作用的研究

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【摘要】：目的:將人結腸癌LS-174-T細胞為研究對象,研究葫蘆素B對于人結腸癌LS-174-T細胞的影響以及具體的分子機制,為將來結腸癌的藥物治療提供一定實驗基礎。方法:在含有10%胎牛血清,100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,將人結腸癌細胞株LS-174-T細胞放入其中,在溫度37℃,5%CO2溫箱中培養(yǎng),待細胞貼壁,取對數生長期細胞進行試驗。采用以下實驗:1 CCK-8法檢測葫蘆素B對LS-174-T細胞的生長抑制作用將處于生長對數期的人結腸癌細胞株LS-174-T細胞消化成單細胞懸液后,調整細胞濃度為5×103/ml,接種于96孔培養(yǎng)板中,每組均設置5個重復孔,分別加入質量濃度為0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L及100.0μmol/L濃度的葫蘆素B,同時設空白組(DMSO溶劑對照組)和陰性對照組(不加藥物組)及調零孔(只加培養(yǎng)基),用CCK-8法通過Ascent酶標儀檢測作用24、48及72h后細胞光密度值(OD值),計算細胞生長抑制率,繪制出細胞生長曲線。2流式細胞術PI染色法收集陰性對照組細胞和藥物組(0.1、1.0μmol/L)作用24h后細胞,收集細胞用預冷PBS重懸細胞,2000rpm離心10min,洗滌細胞,加入300ul Binging Buffer懸浮,避光,室溫孵育15min,上機前5min加入5ul PI,上流式細胞儀檢測。3熒光定量PCR法測定STAT3、caspase-3、及tert m RNA表達水平將人結腸癌LS-174-T細胞混懸后均勻分配為三組,每組設三個樣本。均接種在25m L培養(yǎng)瓶中,隔夜后,分別加入含濃度為0.1、10μmol/L、1μmol/L的葫蘆素B。24h及48h后提取各組總RNA。應用熒光定量PCR對STAT3、caspase-3、及tert基因的表達量進行測定。結果:1葫蘆素B對結腸癌LS-174-T細胞的抑制作用CCK-8結果顯示,葫蘆素B對結腸癌LS-174-T細胞有明顯的生長抑制作用,并且呈時間-劑量依賴性,葫蘆素B作用組(0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L及100.0μmol/L)作用24h后,抑制率分別為(0.52±0.17)%,(11.34±0.13)%,(14.27±0.61)%,(19.73±2.54)%,(74.81±2.12)%,作用72h后,抑制率分別為(0.89±0.21)%,(34.31±0.29)%,(43.01±0.59)%,(71.21±1.77)%,(98.91±0.49)%.最大抑制率為100.0μmol/L作用72h出現(xiàn),為(98.91±0.49)%。2流式PI染色法分析細胞周期變化流式細胞儀PI染色法檢測藥物組和陰性對照組細胞周期變化,結果顯示與陰性對照組相比,不同藥物濃度(0.1、1.0μmol/L)作用24h后,對照組與0.1μmol/L,1.0μmol/L濃度組G0/G1期細胞比例分別為77.41±4.69%,58.31±3.15%和41.13±5.31%;G2/M期細胞比例分別為5.32±0.73%,14.17±0.82%和31.28±4.02%;S/期細胞比例為17.27±3.40%,27.52±4.71%和27.59±8.99%。隨葫蘆素B的濃度增加,處于G2/M期細胞的比例逐漸升高,G0/G1期細胞的比例卻逐漸降低。3熒光定量RT-PCR檢測葫蘆素B對Stat3,tert,及caspase3的m RNA表達量影響藥物(10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L)作用24h及48h后,檢測Stat3,tert,及caspase3的m RNA表達量。結果顯示:Stat3與tert的m RNA表達量減少,與藥物濃度及作用時間呈現(xiàn)時間--劑量依賴性,而caspase3的表達量的增加,與藥物濃度及作用時間呈現(xiàn)時間--劑量依賴性。結論1對于人結腸腺癌LS174-T細胞株,葫蘆素B有非常明顯的抑制其生長的作用,并且與時間和劑量呈正相關。2對于人結腸癌LS-174-T細胞株,葫蘆素B對其抑制作用可能和對細胞周期的影響有關聯(lián)。3葫蘆素B對結腸癌細胞的抑制作用最終可能導致其凋亡。4葫蘆素B作用于Stat3,tert因子,其m RNA表達量的減少呈現(xiàn)時間--劑量依賴性,而tert的m RNA表達量的增加則呈現(xiàn)時間--劑量依賴性。
【關鍵詞】：葫蘆素B 結腸癌 LS174-T 增殖抑制
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：