本文關(guān)鍵詞：miR-630增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞惡性表型的作用與機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：宮頸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,占女性生殖器官惡性腫瘤總數(shù)的半數(shù)以上。放射治療是宮頸癌的主要治療方法之一。但臨床資料顯示,宮頸癌的放療效果仍然有限。研究發(fā)現(xiàn),輻射抗性癌細(xì)胞的存在是宮頸癌患者放療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因。因此,明確調(diào)控宮頸癌輻射抵抗的關(guān)鍵分子和調(diào)控途徑,對(duì)于提高宮頸癌放療效果意義重大。多種信號(hào)通路,如NF-κB、PI3-K/Akt及TGFβ等通路,及多種關(guān)鍵分子,如HIF-1、p53、p21等,已被報(bào)道參與了宮頸癌細(xì)胞的輻射敏感性的調(diào)控。宮頸癌輻射敏感性調(diào)節(jié)機(jī)制是涉及多因素、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程,目前的研究尚未完全闡明,故有待于進(jìn)一步研究。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)在腫瘤轉(zhuǎn)移中具有非常重要的作用,它被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵機(jī)制之一。EMT可使腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)。因此,深入研究腫瘤發(fā)生EMT的分子機(jī)制及相關(guān)重要調(diào)控因子,并對(duì)關(guān)鍵通路的關(guān)鍵分子進(jìn)行干預(yù),理論上可以有效抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。microRNAs(miRNAs)是一類(lèi)新的調(diào)控因子,參與調(diào)控眾多生物學(xué)過(guò)程,在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)生以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),miRNAs在調(diào)控宮頸癌的輻射抗性及侵襲轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮重要作用。本文從miRNA角度探尋宮頸癌輻射抵抗及侵襲轉(zhuǎn)移的作用與機(jī)制,以期尋找關(guān)鍵作用的miRNA分子,將其作為潛在治療靶點(diǎn),從而提高放療療效。研究目的:1.建立輻射抗性宮頸癌細(xì)胞株并篩選抗性細(xì)胞中差異表達(dá)的mirnas。2.驗(yàn)證mir-630對(duì)宮頸癌hela細(xì)胞輻射抗性的調(diào)控作用。3.研究mir-630對(duì)宮頸癌hela細(xì)胞emt的影響。研究方法:1.模擬臨床腫瘤放射治療的分割療法,2gyγ射線連續(xù)照射宮頸癌hela、siha細(xì)胞建立輻射抗性宮頸癌細(xì)胞株。mirna芯片技術(shù)篩選輻射抗性細(xì)胞與親本細(xì)胞中差異表達(dá)的mirnas。2.人宮頸癌hela細(xì)胞分別經(jīng)不同劑量的co60γ射線照射,借助qrt-pcr檢測(cè)輻照后hela細(xì)胞中mir-630的表達(dá)水平。hela細(xì)胞經(jīng)6gyγ射線照射后不同時(shí)間點(diǎn),采用qrt-pcr檢測(cè)mir-630的表達(dá)水平。3.制備mir-630的慢病毒表達(dá)載體,包括上調(diào)mir-630的載體lentivirus-hsa-mir-630,下調(diào)mir-630的載體lentivirus-hsa-mir-630-inhibition,以及空載體lentivirus-negativecontrol,并感染hela細(xì)胞,利用puromycin進(jìn)行穩(wěn)定感染細(xì)胞篩選。通過(guò)qrt-pcr鑒定調(diào)變mir-630表達(dá)的hela細(xì)胞株。4.以調(diào)變mir-630表達(dá)的hela細(xì)胞作為研究模型,采用6gy和8gyγ射線照射,借助mtt法檢測(cè)輻照后3、5、7天的細(xì)胞活性;利用克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞輻照后的細(xì)胞克隆形成能力;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)自發(fā)凋亡及輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;并利用westernblot檢測(cè)細(xì)胞輻照前后凋亡相關(guān)蛋白bax,bcl-2,caspase3,caspase7及caspase9的表達(dá)水平。5.移植瘤實(shí)驗(yàn)觀察調(diào)變mir-630表達(dá)的hela細(xì)胞株的致瘤性。6.借助劃痕實(shí)驗(yàn),rtca細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和transwell侵襲實(shí)驗(yàn),來(lái)觀察mir-630調(diào)變對(duì)宮頸癌hela細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響,采用westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)emt相關(guān)標(biāo)志物e-cadherin、cytokeratin及n-cadherin在mir-630調(diào)變表達(dá)的hela細(xì)胞株中的表達(dá)。7.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證mir-630的靶基因。8.不同乏氧條件處理宮頸癌hela細(xì)胞后通過(guò)qrt-pcr檢測(cè)細(xì)胞中mir-630的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.成功建立輻射抗性宮頸癌細(xì)胞株Hela-R11及Siha-R15,在輻射抗性細(xì)胞中miR-630表達(dá)顯著上調(diào)。2.輻射可誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞中miR-630表達(dá)上調(diào),并具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。3.成功建立穩(wěn)定調(diào)變miR-630的宮頸癌Hela細(xì)胞株。4.miR-630可增強(qiáng)輻射后宮頸癌Hela細(xì)胞的活性及克隆形成能力,降低細(xì)胞的自發(fā)凋亡及輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,miR-630亦可增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá),同時(shí)抑制促凋亡蛋白Bax,Caspase 3,Caspase 7 and Caspase 9表達(dá)。5.miR-630可增強(qiáng)宮頸癌Hela細(xì)胞的致瘤性。6.miR-630可增強(qiáng)Hela細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力,同時(shí)通過(guò)降低上皮標(biāo)志物E-cadherin和Cytokeratin的表達(dá)、升高間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)EMT發(fā)生。7.miR-630對(duì)ZNF-451和IGF1R基因無(wú)直接調(diào)控作用。8.乏氧可快速誘導(dǎo)Hela細(xì)胞中miR-630表達(dá)上調(diào),并長(zhǎng)時(shí)間維持miR-630的高表達(dá)水平。結(jié)論:輻射和乏氧可誘導(dǎo)miR-630在宮頸癌Hela細(xì)胞中表達(dá)。miR-630可通過(guò)抑制輻照誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增強(qiáng)宮頸癌Hela細(xì)胞的輻射抗性。miR-630可誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生EMT從而促進(jìn)Hela細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
【關(guān)鍵詞】：宮頸癌細(xì)胞 miR-630 輻射抗性 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 腫瘤轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R737.33
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 文獻(xiàn)回顧15-24
• 實(shí)驗(yàn)一 宮頸癌輻射抗性細(xì)胞株的建立及差異表達(dá)miRNA篩選24-32
• 1. 材料24-26
• 2. 方法26-28
• 3. 結(jié)果28-30
• 4. 討論30-32
• 實(shí)驗(yàn)二 miR-630對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞輻射抗性的調(diào)控作用32-48
• 1. 材料32-34
• 2. 方法34-38
• 3. 結(jié)果38-44
• 4. 討論44-48
• 實(shí)驗(yàn)三 miR-630對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞EMT的影響48-62
• 1. 材料48-49
• 2. 方法49-54
• 3. 結(jié)果54-60
• 4. 討論60-62
• 小結(jié)62-63
• 參考文獻(xiàn)63-74
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果74-75
• 致謝75

  本文關(guān)鍵詞：miR-630增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞惡性表型的作用與機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：504340