本文關鍵詞：肝癌HepG2細胞CYP2E1基因穩(wěn)定高表達系的構建，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:細胞色素P450E1(CYP2E1)不僅參與藥物代謝,還可以催化多種外源性物質,形成最終的致癌活性物[1]。不僅如此,我們的研究[2-3]還發(fā)現(xiàn)CYP2E1可以通過代謝網(wǎng)絡(如經(jīng)典的CYP2E1-ROS/RNSM1HM/Nos2通路),即憑借其復雜代謝過程中的底物與產(chǎn)物參與基因表達的調控,從而更加深刻的影響細胞的各種功能。腫瘤發(fā)生前后,CYP2E1的差異性表達可能在腫瘤的維持、演進、轉移中發(fā)揮作用。尤其是在CYP2E1高表達、易誘導的肝臟。對CYP2E1的研究有助于闡明其在肝癌的作用和尋找新的治療靶點。本研究旨在通過慢病毒載體構建CYP2E1基因持續(xù)穩(wěn)定高表達的HepG2細胞系,為下一步研究CYP2E1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制奠定基礎。目的:獲取完整CYP2E1基因,構建逆轉錄慢病毒Lenti-Cyp2e1-eG FP-Puro。通過感染HepG2細胞建立穩(wěn)定高表達CYP2E1的肝癌細胞系。為深入研究CYP2E1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制提供理想的細胞模型。方法:通過PCR擴增,電泳分離后切膠回收,獲取完整CYP2E1基因。經(jīng)Invitrogen測序,比對UCSC中CYP2E1的編碼序列,確保攜帶相應酶切位點的CYP2E1準確完整。構建載體質粒pLV(Exp)-Puro-CMVmCYP2E1。將載體質粒,包裝質粒(pMDLg/pRRE、pRSV-REV)經(jīng)E.col i DH5α擴增后,共同轉染293T細胞制取慢病毒。利用攜帶CYP2E1基因的慢病毒(Lenti-Cyp2e1-eGFP-Puro)感染HepG2。采用嘌呤霉素抗性篩選方法分離高表達CYP2E1肝癌HepG2細胞。通過增強綠色熒光蛋白檢測轉染情況,q-PCR及Western blotting檢測HepG2、空載及轉染CYP2E1基因的HepG2細胞系中CYP2E1 mRNA和蛋白的表達情況。結果:經(jīng)Invitrogen測序與UCSC序列配比率為100%。通過含慢病毒培養(yǎng)基轉染,Hep G2細胞系可在12h后表達e GFP熒光蛋白�？蛰d組與高表達組感染效率基本相同。eGFP熒光蛋白率在24h后快速升高,在第4d達到90%,第6d接近100%表達。液氮凍存3個月后復蘇該細胞,HepG2-CYP2E1熒光強度有所減弱,但表達率仍接近100%。轉染CYP2E1基因的HepG2細胞系高表達CYP2E1 mRNA,為正常HepG2表達量的682.70±6.11倍(P0.05),正常HepG2與空載HepG2之間CYP2E1mRNA比較無統(tǒng)計學差異(0.22±0.06、0.36±0.05,P0.05)。正常Hep G2、空載細胞CYP2E1蛋白表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(1.26±0.02、1.29±0.01,P0.05)。病毒轉染的Hep G2細胞CYP2E1蛋白表達量(9.51±0.78)較空載及正常HepG2細胞系高(P均0.01)。結論:1、成功構建了表達CYP2E1基因的載體質粒。2、通過慢病毒轉染建立高表達CYP2E1基因的HepG2細胞系。
【關鍵詞】：CYP2E1基因 慢病毒載體 肝癌 HepG2細胞
【學位授予單位】：川北醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 致謝4-7
• 摘要7-9
• Abstract9-13
• 前言13-17
• 實驗試劑、材料和儀器17-23
• 實驗方法23-41
• 結果41-45
• 討論45-49
• 結論49-50
• 參考文獻50-53
• 綜述：細胞色素P4502E1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用53-67
• 參考文獻62-67
• 附錄67-71
• 個人簡歷71-72

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳孟超;;肝癌外科治療的近期進展[J];中國普外基礎與臨床雜志;2006年02期

2 張志敏;;肝癌會遺傳嗎?[J];肝博士;2006年03期

3 徐連根;周晶;雷偉;沈志祥;;瘦素及其受體在肝癌組織中的表達及意義[J];胃腸病學和肝病學雜志;2006年05期

4 魏麗珍;李勝棉;張楠;溫登瑰;周燁;王士杰;;688例肝癌患者發(fā)病特點及診療狀況分析[J];肝臟;2010年02期

5 ;我國科研人員發(fā)現(xiàn)促進肝癌生長和轉移的相關基因[J];臨床薈萃;2010年10期

6 吳生;;盤點誘發(fā)肝癌的7大元兇[J];肝博士;2012年01期

7 鄧慶華;一家四例肝癌報道[J];中國廠礦醫(yī)學;1995年06期

8 王定珠;;觥籌交錯 過度疲勞 肝癌乘機而入[J];健康博覽;2005年11期

9 笑山,吳蓉蓉;喝咖啡可以減少肝癌發(fā)生率[J];健康之路;2005年04期

10 ;遠離肝癌 預防在先[J];農(nóng)民文摘;2006年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 俞順章;穆麗娜;;飲水中藻類毒素與肝癌關系和控制的研究(摘要)[A];全國腫瘤流行病學和腫瘤病因學學術會議論文集[C];2007年

2 楊秉輝;;肝癌預防的新話題-非酒精性脂肪性肝病與肝癌[A];第十二屆全國肝癌學術會議論文匯編[C];2009年

3 丁光偉;楊玉秀;徐秋霞;徐存拴;;肝癌多基因表達異常初步研究[A];第五屆全國肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學術會議論文匯編[C];2006年

4 吳孟超;;肝癌外科治療的近期進展[A];第三屆全國重型肝病及人工肝血液凈化學術年會論文集（上冊）[C];2007年

5 劉耕陶;孫華北;方亞南;;肝癌發(fā)生的化學預防[A];第十次中國生物物理學術大會論文摘要集[C];2006年

6 阮秀花;田蔥;張效本;張喜梅;;肝癌患者乙型肝炎病毒感染血清流行病學分析[A];第五屆全國肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學術會議論文匯編[C];2006年

7 阮秀花;田蔥;張效本;張喜梅;;肝癌患者乙型肝炎病毒感染血清流行病學分析[A];第五屆全國肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學術會議論文匯編[C];2006年

8 呂巖;韓學鋒;;肝癌患者需求的評估[A];中華醫(yī)學會醫(yī)學工程學分會第八次學術年會暨《醫(yī)療設備信息》創(chuàng)刊20周年慶祝會論文集[C];2006年

9 孫華;魏懷玲;劉耕陶;;雙環(huán)醇對化學毒物促發(fā)肝癌的防治作用及作用機制研究[A];2009醫(yī)學前沿論壇暨第十一屆全國腫瘤藥理與化療學術會議論文集[C];2009年

10 謝靜媛;戴煒;涂愛民;趙文高;符花;胡應龍;;深圳地區(qū)53例肝癌發(fā)生的相關因素探討[A];全國第2屆中西醫(yī)結合傳染病學術會議暨國家中醫(yī)藥管理局第1屆傳染病協(xié)作組會議論文匯編[C];2008年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 湖北宜昌 胡獻國;吸煙與肝癌[N];上海中醫(yī)藥報;2013年

2 四川成都 孫清廉;遠離肝癌 謹防四大危險因素[N];上海中醫(yī)藥報;2013年

3 特約撰稿 北京朝陽醫(yī)院京西院區(qū)肝膽外科主任 孫文兵;警惕肝癌的過度治療[N];醫(yī)藥導報;2007年

4 健康時報特約記者 孫理;三招不得肝癌[N];健康時報;2008年

5 葉建平;專家提醒肝癌患者保護生命 重在“三早”防治[N];中國中醫(yī)藥報;2008年

6 通訊員 韋夏 本報記者 鄧宏鷹 鐘少鴻;不良飲食習慣易誘發(fā)肝癌[N];中國食品報;2009年

7 記者 顧泳;我國肝癌患者占全球55%[N];解放日報;2010年

8 解放軍302醫(yī)院 劉士敬;四成肝癌酒精泡出來的[N];健康時報;2010年

9 記者 顏維琦 曹繼軍;我科學家揭示肝癌發(fā)生早期分子機制[N];光明日報;2012年

10 記者 胡德榮;肝癌發(fā)生早期階段分子機制被揭示[N];健康報;2012年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳放;TOPK蛋白和肝癌發(fā)生以及相關調控機制的研究[D];復旦大學;2011年

2 張怡安;中樞神經(jīng)特異性RNA結合蛋白NOVA1在肝癌中的表達及其促進腫瘤發(fā)展的潛在分子機制探究[D];復旦大學;2014年

3 殷杰;E3泛素連接酶Prp19對肝癌侵襲的影響及其機制研究[D];復旦大學;2014年

4 周宇紅;分化抑制因子ID1在調控化療誘導的肝癌細胞“干性”改變中的作用研究[D];復旦大學;2014年

5 王盛;FOXA1基因變異和調控異常促

本文編號：491480