本文關(guān)鍵詞：P53缺失型HL-60白血病細(xì)胞內(nèi)Nucleostemin下調(diào)對mTOR通路介導(dǎo)的自噬活性的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:結(jié)合本課題組前期關(guān)于p53缺失型HL-60白血病細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT/m TOR通路的研究結(jié)果,進(jìn)一步探討下調(diào)Nucleostemin(NS)對p53缺失型HL-60白血病細(xì)胞內(nèi)m TOR通路介導(dǎo)的自噬活性的影響,為研究PI3K/AKT/m TOR通路作為NS非p53依賴性信號通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)提供依據(jù)。方法:(1)制備重組質(zhì)粒(編碼慢病毒顆粒)和兩種輔助包裝原件的載體質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集富含病毒顆粒的上清液,濃縮后用293T細(xì)胞測定其病毒滴度。(2)分別以低MOI值(MOI=40)和高M(jìn)OI值(MOI=80)的慢病毒轉(zhuǎn)染液感染HL-60細(xì)胞確定慢病毒感染HL-60細(xì)胞的合適MOI值。(3)根據(jù)合適的MOI值,將NS-RNAi-GV248慢病毒載體轉(zhuǎn)染至HL-60細(xì)胞,通過熒光倒置顯微鏡和Western blot確定轉(zhuǎn)染的效率和NS蛋白的下調(diào)情況。(4)采用吖啶橙染色觀察慢病毒載體轉(zhuǎn)染后空白對照組、陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組HL-60細(xì)胞內(nèi)亮紅色酸性小體(acid vesicular organelle,AVO)數(shù)量的變化。(5)以自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素刺激HL-60細(xì)胞所提取的蛋白作為自噬陽性對照蛋白,檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后空白對照組、陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組內(nèi)自噬特異性蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的變化。(6)采用透射電鏡檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后空白對照組、陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組中HL-60細(xì)胞內(nèi)自噬性結(jié)構(gòu)數(shù)量的變化。(7)采用Image J圖像處理軟件對蛋白條帶的灰度進(jìn)行分析和計算。運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。多組樣本間的比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩的比較采用Bonferroni法,校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)α,=0.0167。結(jié)果:(1)成功包裝NS-RNAi-GV248慢病毒載體,其滴度為4×108TU/ml。(2)NS-RNAi-GV248慢病毒載體感染HL-60細(xì)胞的最適MOI值為80。在MOI=80的感染條件下,熒光倒置顯微鏡檢測顯示慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率大于80%,實(shí)驗(yàn)組中HL-60細(xì)胞NS蛋白出現(xiàn)了明顯的下調(diào)。(3)吖啶橙染色結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組HL-60細(xì)胞內(nèi)AVO數(shù)量[(22.4±0.76)%]高于空白對照組[(3.1±0.28)%]和陰性對照組[(6.2±0.64)]%(p0.05);Western blot結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組中HL-60細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值(1.537±0.072)高于陰性對照組(1.010±0.039)和空白對照組(0.608±0.008)(p0.05);透射電鏡檢測顯示實(shí)驗(yàn)組中HL-60細(xì)胞內(nèi)自噬性結(jié)構(gòu)的數(shù)量(8.7±3.1)高于陰性對照組(4.2±1.2)和空白對照組(2.3±0.5)(p0.05)。結(jié)論:(1)下調(diào)NS蛋白的表達(dá)可以增強(qiáng)HL-60細(xì)胞的自噬活性。(2)NS變化引起的自噬活性的改變,提示m TOR通路可能屬于NS的非p53依賴性通路之一,為繼續(xù)研究NS非p53依賴性通路的細(xì)節(jié)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：nucleostemin 非p53依賴性通路 慢病毒載體 自噬 PI3K/AKT/mTOR通路
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.7
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 中英文縮略詞10-11
• 引言11-13
• 1 實(shí)驗(yàn)材料13-18
• 2 實(shí)驗(yàn)方法18-29
• 3 結(jié)果判斷29-31
• 4 結(jié)果31-40
• 5 討論40-46
• 6 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 綜述部分51-64
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 個人簡歷、碩士研究生期間發(fā)表的論文64-65
• 致謝65

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  本文關(guān)鍵詞：P53缺失型HL-60白血病細(xì)胞內(nèi)Nucleostemin下調(diào)對mTOR通路介導(dǎo)的自噬活性的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：487644