發(fā)布時(shí)間：2017-06-26 13:01

  本文關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子降低EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞對(duì)上皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑—吉非替尼的敏感性，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的：非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占據(jù)肺癌的85%。在非小細(xì)胞肺癌病人中,超過65%的病人會(huì)有局部進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。很不幸的是,少于15%的肺癌患者能夠存活超過5年。在過去的十幾年中,特定基因突變檢測(cè)在肺癌中的應(yīng)用,引領(lǐng)肺癌治療進(jìn)入新的靶向時(shí)代。針對(duì)EGFR及ALK (anaplastic lymphoma kinase)在肺癌治療中帶來很好的療效。EGFR-TKI在EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌及crizotinib在ALK重排的非小細(xì)胞肺癌中的治療反應(yīng),生存質(zhì)量,無進(jìn)展生存期相比較于化療而言,都有很大的提升。EGFR-TKI如吉非替尼,厄洛替尼,阿法替尼已被確立為主要的標(biāo)準(zhǔn)治療。這些治療尤其在EGFR突變(外顯子19位缺失突變,L858異位突變)的非小細(xì)胞肺癌中效果顯著。亞洲肺腺癌患者中超過50%會(huì)發(fā)現(xiàn)EGFR突變。盡管大部分的EGFR突變肺癌患者在應(yīng)用TKI初期效果顯著,但是都不可避免的發(fā)生獲得性抵抗。因此固有耐藥和獲得性耐藥成為影響患者療效的重要障礙。目前,已發(fā)現(xiàn)多個(gè)EGFR-TKI耐藥機(jī)制。近期的研究中,新一代的EGFR-TKI在EGFR T790M突變(約占耐藥腫瘤的50%)的肺癌中有取得了較好的療效。而之前我們的研究報(bào)道HGF作為MET受體的配體,會(huì)誘導(dǎo)EGFR突變的肺腺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼或是新一代EGFR-TKIs抵抗,這一現(xiàn)象是通過MET/Gab1/PI3K/AKT途徑實(shí)現(xiàn)的,而不需要經(jīng)過ErbB3,盡管ErbB3在MET擴(kuò)增導(dǎo)致的吉非替尼抵抗中有重要作用。我們同時(shí)又發(fā)現(xiàn),MET抑制劑E7050可以成功克服HGF誘導(dǎo)的EGFR-TKI抵抗。對(duì)于野生型的EGFR進(jìn)展期肺癌患者而言,化療是主要的治療手段。然而,隨著治療的進(jìn)行常常會(huì)發(fā)生化療抵抗,這會(huì)大大降低病人對(duì)化療的臨床受益度。盡管EGFR-TKI在EGFR野生型的非小細(xì)胞肺癌患者中的效果尚有爭(zhēng)議,但是很多臨床試驗(yàn)顯示,在化療后進(jìn)展的患者中,使用EGFR-TKI可以獲得一定的生存獲益。因此,某些指南推薦在EGFR野生型的非小細(xì)胞肺癌患者中,EGFR-TKI可作為可選擇的二線治療手段。考慮到不可避免的藥物抵抗,我們猜想這些耐藥機(jī)制也可能存在于野生型EGFR突變的肺癌中,如果可以在EGFR-TKI治療前就考慮到潛在的耐藥并進(jìn)行處理,那么這類病人可能將從EGFR-TKI治療中獲得更多的受益。由于之前在EGFR突變的肺癌細(xì)胞中已經(jīng)證實(shí)HGF/MET是一個(gè)重要的導(dǎo)致EGFR-TKI耐藥的機(jī)制,因此本研究中我們進(jìn)一步研究了HGF是否也會(huì)導(dǎo)致EGFR野生型腫瘤耐藥。我們的研究發(fā)現(xiàn),HGF通過PI3K/Akt, MAPK途徑顯著降低EGFR野生型肺癌細(xì)胞株對(duì)吉非替尼的敏感性。小分子MET抑制劑,PHA-665752完全逆轉(zhuǎn)了HGF導(dǎo)致的EGFR-TKI耐藥。我們的研究結(jié)果表明,聯(lián)合應(yīng)用EGFR-TKI和MET抑制劑或者抑制下游信號(hào)分子PI3K、MEK,可能是EGFR野生型肺癌患者可選擇的二、三線治療策略。方法：1.EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI敏感性的檢測(cè)檢測(cè)EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞A549,H358對(duì)EGFR-TKI的敏感性。這兩株細(xì)胞均為KRAS突變細(xì)胞。依據(jù)MTT使用說明書,檢測(cè)A549和H358細(xì)胞在不同濃度的EGFR-TKI(吉非替尼和厄洛替尼)下,細(xì)胞的增殖情況。HGF處理后EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI敏感性的檢測(cè)應(yīng)用HGF提前處理細(xì)胞30分鐘后,加入不同濃度的EGFR-TKI gefitinib,繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后,依據(jù)MTT使用說明書,檢測(cè)在有HGF存在情況下兩種EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞A549,H358對(duì)吉非替尼的敏感性變化：同時(shí)應(yīng)用HGF中和性抗體預(yù)處理,檢測(cè)其是否能夠恢復(fù)這兩種細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性;聯(lián)合應(yīng)用MET小分子抑制劑PHA-665752,檢測(cè)其是否能夠恢復(fù)HGF處理后的細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。檢測(cè)EGFR野生型細(xì)胞中MET,EGFR,ErbB3的表達(dá)情況。提取EGFR野生型細(xì)胞A549,H358的總蛋白,應(yīng)用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,配置同等蛋白濃度樣品后,加入SDS-PAGE loading buffer經(jīng)95攝氏度高溫加熱后進(jìn)行蛋白變性,進(jìn)而通過凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,牛奶封閉后,4攝氏度孵育一抗過夜,室溫孵育二抗,經(jīng)洗膜后,采用ECL法檢測(cè)這兩種細(xì)胞的MET,EGFR,ErbB3及其下游信號(hào)的蛋白表達(dá)情況。2.檢測(cè)吉非替尼和/或HGF和/或MET抑制劑處理后A549,H358細(xì)胞中MET,EGFR,ErbB3及其下游信號(hào)蛋白的表達(dá)情況。同樣利用Western blotting方法檢測(cè)各種處理后,EGFR野生型細(xì)胞株中MET, EGFR,ErbB3及其下游信號(hào)的蛋白表達(dá)情況。3.檢測(cè)MET, EGFR, ErbB3三者之間的關(guān)系利用免疫沉淀技術(shù)檢測(cè)HGF和或吉非替尼處理后的MET與EGFR, ErbB3三者之間的關(guān)系。4.檢測(cè)特異性敲除MET或特異性敲除ErbB3能否恢復(fù)細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體的方法轉(zhuǎn)染EGFR野生型細(xì)胞A549和H358,按照lip2000使用說明書進(jìn)行操作,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí),轉(zhuǎn)染專用培養(yǎng)基Opti-MEMI稀釋scramble, MET siRNA, ErbB3 siRNA,以及l(fā)ipofectamine 2000,轉(zhuǎn)染用SIRNA稀釋液與lipofectamine 2000稀釋液分別混合后,室溫靜置20分鐘,加入貼壁的細(xì)胞培養(yǎng)板中,于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4-6小時(shí)后,細(xì)胞換液,換成含有抗生素的完全培養(yǎng)基,則轉(zhuǎn)染完成。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)進(jìn)行對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè),Western Blotting檢測(cè)其相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況以及下游信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況。MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的EGFR野生型細(xì)胞A549和H358對(duì)吉非替尼的敏感情況。5.檢測(cè)高表達(dá)HGF后的EGFR野生型細(xì)胞株對(duì)吉非替尼的敏感性變化構(gòu)建高表達(dá)HGF基因的肺腺癌細(xì)胞株。同siRNA轉(zhuǎn)染相同,應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體的方法攜帶HGF基因,轉(zhuǎn)染EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞。當(dāng)轉(zhuǎn)染完成后,應(yīng)用人HGF ELISA檢測(cè)試劑盒來檢測(cè)轉(zhuǎn)入HGF基因前后的細(xì)胞分泌HGF的情況。同時(shí)利用轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)方法同上,按照MTT的操作執(zhí)行。6.檢測(cè)細(xì)胞下游信號(hào)PI3K/AKT,MAPK通路在野生型肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥中的作用利用western blotting同時(shí)檢測(cè)PI3K小分子抑制劑GSK2126458和PF04691502在EFGR野生型和突變型細(xì)胞PC9中對(duì)PI3K/AKT磷酸化的抑制情況,檢測(cè)MEK抑制劑AZD-8330及TAK-733對(duì)兩種細(xì)胞的ERK1/2磷酸化的抑制情況。應(yīng)用MTT檢測(cè)PI3K小分子抑制劑及MEK小分子抑制劑對(duì)EGFR突變細(xì)胞,EGFR野生型細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況。具體方法如前所示。7.統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩樣本均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)(Independent-Sample T Test),兩組以上樣本均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析(One-Way ANOVA)。結(jié)果：1.EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的中度敏感兩種EGFR野生型細(xì)胞A549,H358經(jīng)不同濃度的EGFR-TKI(吉非替尼,厄洛替尼)處理,經(jīng)MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力。結(jié)果顯示,兩種EGFR-TKI藥物對(duì)EGFR野生型細(xì)胞增殖均表現(xiàn)出中等抑制作用。2.HGF降低EGFR野生型細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性HGF提前處理EGFR野生型細(xì)胞30分鐘后再用不同濃度的吉非替尼處理A549、H358細(xì)胞,MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)HGF處理后的細(xì)胞對(duì)吉非替尼產(chǎn)生抵抗作用；若同時(shí)應(yīng)用HGF中和性抗體/空白IgG作用HGF處理后的細(xì)胞,再檢測(cè)細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性,發(fā)現(xiàn)應(yīng)用了HGF中和性抗體后的細(xì)胞會(huì)恢復(fù)細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性,而使用空白抗體的細(xì)胞則仍對(duì)吉非替尼耐藥。這就說明HGF會(huì)降低EGFR野生型細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。3.EGFR野生型細(xì)胞中表達(dá)MET,EGFR,ErbB3通過western blotting檢測(cè)到EGFR野生型細(xì)胞A549,H358細(xì)胞中均表達(dá)MET,EGFR,ErbB3并且有不同程度的磷酸化,同時(shí)發(fā)現(xiàn)其下游信號(hào)蛋白AKT及ERK1/2亦有磷酸化。4.HGF通過MET介導(dǎo)下游信號(hào)蛋白AKT及ERK1/2的活化降低EGFR野生型細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性Western blotting檢測(cè)各種處理組后的蛋白顯示,吉非替尼可以明顯抑制MET,EGFR,ErB3,Akt及ERK1/2的磷酸化。單獨(dú)HGF或PHA-665257處理均不能影響EGFR,ErB3的磷酸化。然而HGF可以激活MET,MET的磷酸化會(huì)被PHA-665257抑制。重要的是,即使在吉非替尼存在的情況下,HGF亦可以恢復(fù)Akt及ERK1/2的活化,但不能影響EGFR,ErB3的活化。進(jìn)一步聯(lián)合PHA-665257和吉非替尼會(huì)抑制MET活化,并同時(shí)抑制下游Akt及ERK1/2的磷酸化。這些結(jié)果表明,與EGFR突變的肺癌細(xì)胞相同,HGF導(dǎo)致EGFR野生型細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性下降是通過MET介導(dǎo)的下游Akt及ERK1/2的活化實(shí)現(xiàn)的。5.HGF導(dǎo)致EGFR野生型細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性下降與ErbB3無關(guān)在EGFR突變的肺癌中MET基因擴(kuò)增及HGF作用均可以導(dǎo)致EGFR-TKI耐藥,但是ErbB3活化僅僅發(fā)生在MET基因擴(kuò)增導(dǎo)致的耐藥,并不存在于HGF導(dǎo)致的耐藥中。那么在EGFR野生型的肺癌細(xì)胞中是否也是如此呢?Western Blotting顯示在吉非替尼存在的情況下,HGF可以恢復(fù)Akt及ERK1/2的活化,但不能影響EGFR,ErB3的活化。并且在免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中,不論用吉非替尼處理還是用HGF處理,沉淀MET均不能沉淀下ErbB3。相反,MET本身與EGFR結(jié)合,而這種結(jié)合可以被吉非替尼所抑制。這就表明MET與EGFR的結(jié)合與EGFR的磷酸化狀態(tài)相關(guān)。進(jìn)一步HGF在吉非替尼抑制的情況下不能夠恢復(fù)MET與EGFR的關(guān)系。這些結(jié)果均證明HGF導(dǎo)致EGFR野生型細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI敏感性下降是通過MET信號(hào)途徑發(fā)揮作用的,而非通過ErbB3實(shí)現(xiàn)的。6.特異性敲除MET,而不是ErbB3可以恢復(fù)細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性,這一現(xiàn)象是通過抑制HGF-介導(dǎo)的Akt和ERKl/2磷酸化實(shí)現(xiàn)的。用特異性ErbB3 siRNA敲除后不能影響HGF誘導(dǎo)后細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性,亦不能抑制HGF導(dǎo)致EGFR野生型細(xì)胞H358及A549的Akt, ErbB3的磷酸化。相反,下調(diào)MET的表達(dá)可以恢復(fù)細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性,同時(shí)亦可以抑制AKT及ErbB3的磷酸化。這些結(jié)果表明HGF導(dǎo)致的EGFR野生型肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性降低是通過MET磷酸化進(jìn)而恢復(fù)AKT及ErbB3的磷酸化,與ErbB3無關(guān)。7.高表達(dá)HGF的野生型EGFR肺腺癌細(xì)胞會(huì)降低對(duì)吉非替尼的敏感性將HGF基因轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染之前,H358及A549不分泌HGF；轉(zhuǎn)染HGF基因后可檢測(cè)到高水平的HGF分泌。同預(yù)測(cè)一致,轉(zhuǎn)染HGF的細(xì)胞會(huì)對(duì)吉非替尼產(chǎn)生明顯的抵抗,空轉(zhuǎn)載體的細(xì)胞則不會(huì)出現(xiàn)這一現(xiàn)象。同時(shí),經(jīng)MET小分子抑制劑PHA665752處理后,轉(zhuǎn)入HGF基因的細(xì)胞又會(huì)恢復(fù)對(duì)吉非替尼的敏感性。這些結(jié)果均表明在EGFR野生型的肺腺癌細(xì)胞中,腫瘤細(xì)胞來源的HGF會(huì)降低細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。8.野生型EGFR肺癌細(xì)胞中,PI3K/Akt及MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞對(duì)吉非替尼抵抗中發(fā)揮重要作用。有研究表明PI3K/Akt信號(hào)通路在EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞獲得性耐藥中發(fā)揮重要作用。因此,我們利用P13K抑制劑和MEK抑制劑來確認(rèn)在EGFR野生型的非小細(xì)胞肺癌中這PI3K/Akt及MAPK及其下游信號(hào)通路是否也同樣發(fā)揮重要的作用。P13K抑制劑GSK2126458和PF04691502能夠明顯抑制Akt的磷酸化,同時(shí)可以明顯的抑制EGFR突變細(xì)胞PC9及EGFR野生型細(xì)胞A549的生長(zhǎng)。然而MEK抑制劑AZD-8330和TAK-733盡管可以很好的抑制ERK1/2的磷酸化表達(dá),在抑制細(xì)胞生長(zhǎng)方面,對(duì)于EGFR突變型細(xì)胞PC9的抑制遠(yuǎn)不如對(duì)野生型細(xì)胞A549的抑制。這表明同EGFR突變型細(xì)胞相反,PI3K/Akt及MAPK信號(hào)通路在EGFR野生型細(xì)胞中均發(fā)揮重要作用。結(jié)論：1.HGF降低EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性2.HGF降低EGFR野生型細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性是直接通過恢復(fù)Akt及ERK1/2的磷酸化實(shí)現(xiàn)的3.特異性敲除MET,而不是ErbB3可以恢復(fù)細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性,這一現(xiàn)象是通過抑制HGF-介導(dǎo)的Akt和ERK1/2磷酸化實(shí)現(xiàn)的。4.高表達(dá)HGF的野生型EGFR肺腺癌細(xì)胞會(huì)降低對(duì)吉非替尼的敏感性5.野生型EGFR肺癌細(xì)胞中,PI3K/Akt及MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞對(duì)吉非替尼抵抗中發(fā)揮重要作用。
【關(guān)鍵詞】：HGF EGFR野生型肺癌細(xì)胞 EGFR-TKI敏感性
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-16
• 前言16-26
• 1. 材料與設(shè)備26-28
• 1.1 細(xì)胞及藥物26
• 1.2 主要試劑26-27
• 1.3 主要緩沖液27
• 1.4 主要設(shè)備27-28
• 2. 方法28-35
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)28
• 2.2 藥物配置28
• 2.3 細(xì)跑轉(zhuǎn)染28-29
• 2.4 MTT細(xì)胞X椫呈笛榧觳
  
  本文編號(hào)：486189
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