發(fā)布時間：2017-06-23 15:17

  本文關(guān)鍵詞：牛β-乳球蛋白在人腸道腫瘤細(xì)胞中相互作用蛋白的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：p-乳球蛋白(p-lactoglobulin, β-LG)是乳清蛋白的主要成分,屬于Lipocalin家族,能和視黃醇、p-胡蘿卜素、維生素D等脂溶性小分子化合物結(jié)合,起到載體作用,因此,具有應(yīng)用于口服結(jié)腸定位給藥系統(tǒng)的潛力。由于p-LG具有保護(hù)脂溶性小分子不受胃腸道環(huán)境影響的作用,研究p-LG進(jìn)入腸道細(xì)胞的方式具有重要意義。目前關(guān)于p-LG受體的報道還比較少,只有關(guān)于人惡性多發(fā)性畸胎瘤細(xì)胞、紅細(xì)胞、生殖細(xì)胞、哺乳動物雜交瘤細(xì)胞中受體的研究,有關(guān)p-乳球蛋白在腸道細(xì)胞中受體的研究還未見報道。本課題通過免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)技術(shù)結(jié)合一維聚丙烯酰胺凝膠電泳以及納升級液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(nanoLC-MS/MS)技術(shù)研究牛p-LG在腸道腫瘤細(xì)胞中的識別受體。選擇體外腸道腫瘤研究較為常用的細(xì)胞株Caco-2細(xì)胞和LoVo細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),作為本課題的受試細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞形態(tài)伸展連接成片,傳代后72 h時細(xì)胞匯合度達(dá)到90%以上。LoVo細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,48 h時匯合度達(dá)到90%。將受試細(xì)胞以106個/mL的濃度接種于玻底培養(yǎng)皿。使用熒光探針分別標(biāo)記細(xì)胞膜、細(xì)胞核；激光共聚焦顯微鏡觀察熒光標(biāo)記的p-LG與細(xì)胞作用0 min、15 min、30 min、60 min時p-乳球蛋白與細(xì)胞的相互作用情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在p-LG分別與Caco-2細(xì)胞和LoVo細(xì)胞相互孵育的0-30 min內(nèi),p-LG隨時間的延長逐漸在細(xì)胞膜外側(cè)聚集,但在30-60 min內(nèi)β-LG在細(xì)胞膜外側(cè)的聚集量沒有明顯變化。進(jìn)一步研究p-LG與腸道腫瘤細(xì)胞的相互作用,將p-LG與Caco-2細(xì)胞和LoVo細(xì)胞分別進(jìn)行1h孵育后,使用Co-IP分離p-LG及其在腸道腫瘤細(xì)胞上的相互作用蛋白。將Co-IP分離下來的樣品進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)電泳、考馬斯亮藍(lán)染色、免疫印跡法檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Co-IP分離出的樣品經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離后、考馬斯亮藍(lán)染色觀察發(fā)現(xiàn),在20-70 kDa之間存在蛋白條帶,但無法觀察到β-LG的蛋白條帶；經(jīng)免疫印跡法檢測,發(fā)現(xiàn)Co-IP分離出的樣品存在β-LG,說明Co-IP成功分離β-LG及其腸道腫瘤細(xì)胞相互作用蛋白。利用硝酸銀染色法和nanoLC-MS/MS技術(shù)鑒定β-LG在腸道腫瘤細(xì)胞Caco-2細(xì)胞和LoVo細(xì)胞的相互作用蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩株腸道腫瘤細(xì)胞中存在與β-LG相互作用的蛋白可能是組蛋白H4、核糖體蛋白S18、S25,共3種蛋白,但未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞受體。
【關(guān)鍵詞】：β-乳球蛋白 免疫共沉淀 口服結(jié)腸給藥系統(tǒng) 免疫印跡
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.3
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 緒論10-23
• 1.1 大腸癌現(xiàn)狀10-11
• 1.2 口服結(jié)腸定位給藥系統(tǒng)研究進(jìn)展11-15
• 1.3 β-乳球蛋白的研究進(jìn)展15-21
• 1.3.1 β-乳球蛋白來源15-16
• 1.3.2 β-乳球蛋白分子結(jié)構(gòu)16-17
• 1.3.3 β-乳球蛋白生物活性及研究進(jìn)展17-18
• 1.3.4 β-乳球蛋白耐水解特性及研究進(jìn)展18-19
• 1.3.5 β-乳球蛋白致敏性及研究進(jìn)展19-21
• 1.4 課題研究意義和內(nèi)容21-23
• 1.4.1 課題研究意義21-22
• 1.4.2 課題研究內(nèi)容22-23
• 第二章 激光共聚焦顯微鏡觀察腸道腫瘤細(xì)胞和β-LG的相互作用23-40
• 2.1 引言23-24
• 2.2 材料與方法24-28
• 2.2.1 材料與試劑24-25
• 2.2.2 儀器設(shè)備25
• 2.2.3 試驗方法25-28
• 2.3 結(jié)果與討論28-38
• 2.3.1 腸道腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)與觀察28-30
• 2.3.2 激光共聚焦觀察β-LG與LoVo細(xì)胞的相互作用30-34
• 2.3.3 激光共聚焦觀察β-LG與Caco-2細(xì)胞的相互作用34-38
• 2.4 小結(jié)38-40
• 第三章 免疫共沉淀鑒定腸道腫瘤細(xì)胞與β-LG的相互作用40-52
• 3.1 引言40-41
• 3.2 材料與方法41-46
• 3.2.1 材料與試劑41-42
• 3.2.2 儀器設(shè)備42
• 3.2.3 實驗方法42-46
• 3.3 結(jié)果與討論46-51
• 3.3.1 BCA法檢測蛋白濃度46-47
• 3.3.2 免疫共沉淀樣品的Western Blot分析47-51
• 3.4 小結(jié)51-52
• 第四章 nanoLC-MS/MS鑒定腸道腫瘤細(xì)胞中與β-LG相互作用蛋白52-63
• 4.1 引言52
• 4.2 材料與方法52-55
• 4.2.1 材料與試劑52-53
• 4.2.2 儀器設(shè)備53
• 4.2.3 實驗方法53-55
• 4.3 結(jié)果與討論55-62
• 4.3.1 β-LG免疫共沉淀復(fù)合物SDS-PAGE凝膠的銀染分析55-57
• 4.3.2 差異條帶的質(zhì)譜鑒定57-62
• 4.4 小結(jié)62-63
• 第五章 結(jié)論與展望63-65
• 5.1 結(jié)論63-64
• 5.2 展望與不足64-65
• 參考文獻(xiàn)65-73
• 附錄73-75
• 附錄1：質(zhì)譜檢測Co-IP分離樣品總離子流圖73-75
• 致謝75-76
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況76

【參考文獻(xiàn)】

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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本文編號：475483