本文關(guān)鍵詞：通過調(diào)控ROS建立人乳腺癌多藥耐藥細胞株及其機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:通過調(diào)控ROS建立人乳腺癌多藥耐藥細胞株并研究其機制。方法:通過DCFH-DA染色、激光共聚焦顯微鏡觀察MCF-7及其耐藥株MCF-7/ADM細胞內(nèi)熒光強度及分布,流式細胞儀檢測MCF-7及其耐藥株MCF-7/ADM細胞內(nèi)ROS含量差異。使用不同濃度H2O2、GSH作用不同時間,MTT法檢測阿霉素(ADM)對MCF-7細胞的抑制作用,根據(jù)實驗結(jié)果選定H2O2的造模濃度為0.001,0.01,0.1μmol/L,造模時間為20周,耐藥性最高者命名為MCF-7/ROS細胞;選定GSH的造模濃度為0.001,0.01,0.1 mmol/L,造模時間為12周,耐藥性最高者命名為MCF-7/GSH細胞。采用MTT法測定各濃度阿霉素、紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶、長春新堿、氨魯米特、環(huán)磷酰胺對MCF-7/ROS細胞的抑制率,計算IC50及耐藥指數(shù);SRB法檢測各濃度紫杉醇對MCF-7/GSH細胞的抑制率,計算IC50及耐藥指數(shù)。倒置顯微鏡下觀察所建耐藥細胞株的形態(tài)學(xué)變化。運用PI單染法、流式細胞術(shù)檢測MCF-7、MCF-7/ADM、MCF-7/ROS、MCF-7/GSH細胞的周期分布。采用流式細胞術(shù)檢測所建耐藥細胞內(nèi)ROS的含量變化;高內(nèi)涵細胞術(shù)觀察ROS在MCF-7、MCF-7/ADM、MCF-7/ROS細胞內(nèi)的分布情況。采用Western blot法檢測各組細胞MRP1和P-gp表達的劑量依賴性及時間依賴性關(guān)系;激光共聚焦顯微鏡觀察MCF-7,MCF-7/ROS細胞中MRP1和P-gp的表達及分布。流式細胞術(shù)檢測所建耐藥細胞對Rh123的累積能力�；瘜W(xué)法檢測MCF-7/ROS和MCF-7/GSH細胞內(nèi)GPx和GSH的含量、SOD和Catalase的活性變化。通過使用工具藥Y294002、PD98059、PDTC和Staurosporine,MTT法檢測MCF-7、MCF-7/ADM、MCF-7/ROS和MCF-7/GSH細胞對ADM耐藥性的變化;Western blot法檢測細胞內(nèi)p-Akt、p-ERK、p-I-?B、PKCα、P-gp、MRP1、GSTπ的表達,分析MCF-7/ROS和MCF-7/GSH細胞耐藥產(chǎn)生的機制。采用激光共聚焦顯微鏡檢測MCF-7及MCF-7/ROS細胞中耐藥相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2,NF-κB,HIF-1α的表達與分布。結(jié)果:耐藥細胞MCF-7/ADM內(nèi)ROS含量約為敏感株細胞的2.77±0.21倍,且呈均勻分布。長期孵育H2O2及GSH均可誘導(dǎo)MCF-7細胞產(chǎn)生多藥耐藥,且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。其中0.1μmol/L的H2O2連續(xù)孵育20周及0.1 mmol/L的GSH連續(xù)孵育12周所誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥性最強;分別命名為MCF-7/ROS和MCF-7/GSH細胞。此后隨孵育時間延長,細胞耐藥性未出現(xiàn)顯著性改變。MCF-7/ROS細胞對阿霉素、紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶、長春新堿、氨魯米特、環(huán)磷酰胺的耐藥指數(shù)分別為13.99、4.61、5.32、1.73、8.80、4.06、3.49,MCF-7/GSH細胞對紫杉醇的耐藥指數(shù)為3.29。與MCF-7相比,MCF-7/ADM、MCF-7/ROS、MCF-7/GSH耐藥細胞的G2/M期所占比例有顯著增加,而MCF-7/GSH細胞S期所占比例則相對減少。流式細胞術(shù)及高內(nèi)涵細胞術(shù)檢測結(jié)果表明長期孵育H2O2及GSH均可降低MCF-7細胞內(nèi)的ROS含量。Western blot和激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果表明,長期調(diào)控ROS可劑量、時間依賴性誘導(dǎo)MCF-7細胞表達MRP1和P-gp,且該外排蛋白主要分布于細胞膜上;此外,各模型組細胞對Rh123的累積能力均顯著降低。與MCF-7相比,MCF-7/ROS與MCF-7/ADM耐藥細胞內(nèi)GPx和GSH含量均高于敏感株,但SOD和Catalase活性與敏感株相比無顯著差異;MCF-7/GSH細胞則表現(xiàn)為GPx含量降低,而GSH含量與SOD、Catalase活性均有顯著升高。機制研究表明:PI3K、ERK、NF-κB和PKC的抑制劑均可不同程度地逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADM、MCF-7/ROS和MCF-7/GSH細胞的耐藥性。其中,對于MCF-7/ROS細胞,LY294002、PD98059均可顯著下調(diào)MRP1、P-gp的表達;LY294002可顯著下調(diào)GSTπ的表達。對于MCF-7/GSH細胞,LY294002、PDTC、PD98059可顯著下調(diào)MRP1的表達;LY294002、PDTC可顯著下調(diào)P-gp的表達;LY294002、Staurosporine可顯著下調(diào)GSTπ的表達。此外,MCF-7/ROS細胞中Nrf2,NF-κB,HIF-1α的表達均顯著高于其敏感株MCF-7細胞,其中過量表達的Nrf2與HIF-1α均于核內(nèi)聚集。結(jié)論:耐藥株MCF-7/ADM細胞內(nèi)ROS的含量顯著高于其敏感株MCF-7細胞。通過雙向調(diào)控ROS,對敏感MCF-7細胞長期孵育低劑量的H2O2和GSH,可分別建立MCF-7/ROS和MCF-7/GSH耐藥細胞模型,且該模型細胞均具有腫瘤多藥耐藥的特點。所建耐藥細胞特征主要體現(xiàn)為:細胞周期的變化、細胞內(nèi)ROS含量的變化、外排蛋白功能與表達的變化、細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的變化等。耐藥機制可能涉及PI3K、ERK、NF-κB和PKC信號通路,最終通過上調(diào)細胞內(nèi)MRP1、P-gp和GSTπ的功能與表達介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥的產(chǎn)生。此外,在MCF-7/ROS細胞中,ROS或可通過激活Nrf2,HIF-1α等核轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)多藥耐藥。
【關(guān)鍵詞】：MDR ROS MCF-7 P-gp MRP1 信號通路
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 前言12-16
• 參考文獻13-16
• 第一章 通過調(diào)控ROS建立人乳腺癌耐藥細胞株16-30
• 1 實驗材料17-19
• 1.1 藥品與試劑17-18
• 1.2 主要儀器18-19
• 2 實驗方法19-22
• 2.1 MCF-7 和MCF-7/ADM細胞的培養(yǎng)19
• 2.2 檢測人乳腺癌細胞MCF-7 及MCF-7/ADM中ROS含量19-20
• 2.3 MCF-7/ROS的建立及耐藥性檢測20-21
• 2.4 MCF-7/GSH的建立及耐藥性檢測21-22
• 3 統(tǒng)計學(xué)處理22
• 4 結(jié)果22-27
• 4.1 人乳腺癌細胞MCF-7 及MCF-7/ADM中ROS含量差異22-23
• 4.2 MCF-7/ROS的建立及耐藥性評價23-24
• 4.3 MCF-7/GSH的建立及耐藥性評價24-27
• 5 討論27-29
• 6 小結(jié)29
• 參考文獻29-30
• 第二章 通過調(diào)控ROS誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥的細胞特征研究30-54
• 1 實驗材料33-35
• 1.1 藥品與試劑33-35
• 1.2 主要儀器35
• 2 實驗方法35-41
• 2.1 MTT法檢測細胞耐藥倍數(shù)35-36
• 2.2 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化36
• 2.3 流式細胞儀檢測細胞周期36
• 2.4 流式細胞儀和高內(nèi)涵細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS含量與分布36-37
• 2.5 Western Blot法測定各組細胞內(nèi)MRP1、P-gp的表達37-39
• 2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)MRP1、P-gp的表達與分布39
• 2.7 流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)Rh123的累積39-40
• 2.8 化學(xué)法檢測細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的特點40-41
• 3 統(tǒng)計學(xué)處理41
• 4 結(jié)果41-48
• 4.1 MCF-7/ROS、MCF-7/GSH細胞具有多藥耐藥性41-42
• 4.2 所建耐藥細胞的形態(tài)學(xué)特點42
• 4.3 所建耐藥細胞的周期變化特點42-43
• 4.4 所建耐藥細胞內(nèi)ROS含量與分布的特點43-45
• 4.5 各組細胞內(nèi)MRP1、P-gp的表達情況45
• 4.6 細胞內(nèi)MRP1、P-gp的表達與分布情況45-47
• 4.7 各組細胞耐藥蛋白的外排功能47
• 4.8 所建耐藥細胞的抗氧化系統(tǒng)特點47-48
• 5 討論48-50
• 6 小結(jié)50-51
• 參考文獻51-54
• 第三章 ROS誘導(dǎo)多藥耐藥的機制研究54-74
• 1 實驗材料56-58
• 1.1 藥品與試劑56-58
• 1.2 主要儀器58
• 2 實驗方法58-61
• 2.1 MTT法檢測通路抑制劑對細胞耐藥性的影響58-59
• 2.2 Western blot法檢測細胞內(nèi)耐藥相關(guān)蛋白的表達59-61
• 2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子的表達及分布61
• 3 統(tǒng)計學(xué)處理61
• 4 實驗結(jié)果61-66
• 4.1 抑制劑可不同程度地逆轉(zhuǎn)細胞的耐藥性61-62
• 4.2 耐藥細胞內(nèi)相關(guān)通路的蛋白表達62-64
• 4.3 MCF-7/ROS細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子的表達與分布64-66
• 5 討論66-67
• 6 小結(jié)67-68
• 參考文獻68-74
• 第四章 綜述 通過調(diào)控ROS治療耐藥腫瘤的研究進展74-90
• 參考文獻82-90
• 英文縮略詞表（Abbreviations and acronyms）90-92
• 致謝92-93
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文93-94

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