發(fā)布時(shí)間：2017-06-22 05:03

  本文關(guān)鍵詞：新型拉曼探針的制備及其在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本文結(jié)合納米技術(shù)、DNA自組裝技術(shù)及表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)技術(shù)等,提出了一種新型拉曼探針的制備方法,并將這種新型的拉曼探針應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞表面雙組分的同時(shí)檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞表面活性物質(zhì)分布情況的成像分析研究,同時(shí)將納米技術(shù)結(jié)合酶循環(huán)放大技術(shù)應(yīng)用于DNA甲基化酶的檢測(cè)研究,本論文主要從以下三個(gè)方面進(jìn)行了闡述：第一部分提出了基于納米技術(shù)和DNA自組裝技術(shù)制備新型拉曼探針的方法,通過設(shè)計(jì)不同堿基序列的三種莖環(huán)DNA,通過金-硫鍵(Au-S)將莖環(huán)DNA修飾到金納米粒子的表面,從而制得納米金生物條碼。在引發(fā)鏈DNA存在的情況下,通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,引發(fā)鏈DNA與莖環(huán)DNA結(jié)合并將莖環(huán)DNA打開,莖環(huán)DNA裸露出的一端又可以與另一個(gè)莖環(huán)DNA分子互補(bǔ)配對(duì)打開并裸露出一段DNA鏈,這樣就會(huì)引發(fā)一系列的莖環(huán)DNA的自組裝,最終可以得到一個(gè)具有枝狀結(jié)構(gòu)的納米球,即為所需的新型的拉曼探針,通過莖環(huán)DNA分子的自組裝,可以將大量的拉曼信號(hào)分子和納米金結(jié)合到一起,從而實(shí)現(xiàn)了拉曼信號(hào)的放大。第二部分提出了一種基于DNA-納米金自組裝技術(shù)和表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)技術(shù)同時(shí)檢測(cè)人類乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)表面雙組分活性物質(zhì)(MUC 1粘蛋白和核仁素)的一種方法并對(duì)其進(jìn)行成像分析。首先制備了兩種拉曼探針,分別標(biāo)記兩種腫瘤標(biāo)志物,為檢測(cè)兩種活性物質(zhì),設(shè)計(jì)了兩種不同的識(shí)別探針,具有特異性識(shí)別功能的適體不僅能夠捕獲腫瘤細(xì)胞,而且適體鏈的另一端可以與拉曼探針結(jié)合,用Cy3修飾的拉曼探針標(biāo)記MUC1粘蛋白,Rox修飾的拉曼探針標(biāo)記核仁素,利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)對(duì)兩種信號(hào)分子進(jìn)行檢測(cè),通過選取兩種信號(hào)分子的特征峰對(duì)兩種標(biāo)志物進(jìn)行成像分析,可以清晰地看到兩種組分在腫瘤細(xì)胞表面的分布情況。與單一組分物質(zhì)的檢測(cè)相比,雙組分腫瘤標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)能夠?yàn)榘┌Y的臨床醫(yī)療診斷和其在腫瘤發(fā)展階段的機(jī)理研究提供更多的幫助。第三部分提出了一種基于納米金技術(shù)、酶循環(huán)放大技術(shù)和表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)技術(shù)檢測(cè)DNA甲基化酶的方法,在這種方法中,通過設(shè)計(jì)莖環(huán)DNA分子序列,DNA甲基化酶會(huì)在特定堿基識(shí)別序列的腺嘌呤上修飾上甲基,具有相同識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶DPnI會(huì)將其剪開,并釋放出一條新的DNA鏈,通過已修飾莖環(huán)DNA分子的磁性微球捕獲這條新的DNA鏈,并結(jié)合由金納米粒子制備的拉曼探針,在DNA聚合酶和dNTPs的作用下實(shí)現(xiàn)了DNA鏈的循環(huán)利用和表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)的放大,通過這種方法檢測(cè)甲基化酶的檢測(cè)限可達(dá)5.0×10-6U/μL。
【關(guān)鍵詞】：納米金 DNA自組裝 腫瘤標(biāo)志物 表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)
【學(xué)位授予單位】：青島科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R73-3;O657.37
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 緒論11-31
• 1.1 拉曼光譜簡(jiǎn)介11-20
• 1.1.1 拉曼光譜的原理11-12
• 1.1.2 拉曼光譜的特征12-13
• 1.1.3 影響拉曼光譜的主要因素13-14
• 1.1.3.1 影響定量測(cè)定的因素13-14
• 1.1.3.2 內(nèi)標(biāo)選擇14
• 1.1.4 拉曼光譜技術(shù)14-16
• 1.1.4.1共振拉曼光譜技術(shù)15
• 1.1.4.2 表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)15-16
• 1.1.4.3 傅里葉變換拉曼光譜技術(shù)16
• 1.1.5 拉曼光譜儀16-18
• 1.1.5.1 結(jié)構(gòu)概述16-17
• 1.1.5.2 基本部件17-18
• 1.1.5.3 激光共聚焦拉曼光譜儀18
• 1.1.6 拉曼光譜的應(yīng)用領(lǐng)域18-19
• 1.1.7 拉曼成像技術(shù)19-20
• 1.2 拉曼探針20-24
• 1.2.1 金納米粒子20-23
• 1.2.1.1 金納米粒子的簡(jiǎn)介20
• 1.2.1.2 金納米粒子的性質(zhì)20-21
• 1.2.1.3 金納米粒子的應(yīng)用21-23
• 1.2.2 銀納米粒子23-24
• 1.2.2.1 銀納米粒子的簡(jiǎn)介23
• 1.2.2.2 銀納米粒子的應(yīng)用23-24
• 1.3 腫瘤和腫瘤標(biāo)志物24-25
• 1.3.1 腫瘤24
• 1.3.2 腫瘤標(biāo)志物24-25
• 1.3.3 腫瘤細(xì)胞25
• 1.4 DNA循環(huán)放大技術(shù)25-30
• 1.4.1 概述25-26
• 1.4.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)26-27
• 1.4.3 滾環(huán)復(fù)制放大(RCA)技術(shù)27-28
• 1.4.4 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)技術(shù)28-29
• 1.4.5 DNA鏈取代技術(shù)29-30
• 1.5 課題意義及主要研究?jī)?nèi)容30-31
• 2 基于納米技術(shù)和DNA自組裝技術(shù)制備新型拉曼探針及探針表征31-45
• 2.1 前言31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分31-36
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器31-33
• 2.2.1.1 試劑31-33
• 2.2.1.2 儀器33
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法33-36
• 2.2.2.1 金納米粒子的制備33-34
• 2.2.2.2 單個(gè)金納米探針(H_1-B_1-AuNPs)的制備34
• 2.2.2.3 新型拉曼探針的組裝34
• 2.2.2.4 探針拉曼光譜的測(cè)定34-35
• 2.2.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳35-36
• 2.3 結(jié)果與討論36-44
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)原理36
• 2.3.2 掃描電鏡表征36-37
• 2.3.3 透射電鏡表征37-38
• 2.3.4 探針的紫外光譜表征38-39
• 2.3.5 探針的熒光光譜表征39-40
• 2.3.6 金納米探針上兩種DNA比例的優(yōu)化40-41
• 2.3.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳表征41
• 2.3.8 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化41-42
• 2.3.9 探針的拉曼光譜表征42-44
• 2.3.9.1 探針的拉曼光譜圖42-43
• 2.3.9.2 DNA自組裝的放大作用43-44
• 2.4 本章小結(jié)44-45
• 3 腫瘤細(xì)胞表面雙組分活性物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)及成像分析45-59
• 3.1 前言45-46
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分46-51
• 3.2.1 試劑與儀器46-48
• 3.2.1.1 試劑46-48
• 3.2.1.2 儀器48
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法48-51
• 3.2.2.1 金納米粒子的制備48
• 3.2.2.2 兩種拉曼探針的制備48-49
• 3.2.2.3 兩種熒光探針的制備49
• 3.2.2.4 乳腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)49-50
• 3.2.2.5 拉曼探針與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合50
• 3.2.2.6 細(xì)胞表面拉曼檢測(cè)及成像50
• 3.2.2.7 熒光探針與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合50
• 3.2.2.8 細(xì)胞表面的熒光成像50-51
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論51-58
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)原理51
• 3.3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳表征51-52
• 3.3.3 適體的特異性研究52-53
• 3.3.4 DNA自組裝放大作用的驗(yàn)證53-54
• 3.3.5 細(xì)胞與探針反應(yīng)溫度的優(yōu)化54-55
• 3.3.6 細(xì)胞表面的拉曼成像分析55-56
• 3.3.7 細(xì)胞表面的熒光成像分析56-57
• 3.3.8 人類口腔上皮細(xì)胞的拉曼成像對(duì)比57-58
• 3.4 本章小結(jié)58-59
• 4 基于酶循環(huán)放大表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)甲基化酶的研究59-70
• 4.1 前言59
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分59-63
• 4.2.1 試劑與儀器59-61
• 4.2.1.1 試劑59-60
• 4.2.1.2 儀器60-61
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法61-63
• 4.2.2.1 金納米粒子的制備61
• 4.2.2.2 拉曼探針的制備61-62
• 4.2.2.3 磁性微球的活化62
• 4.2.2.4 DNA在磁性微球表面的固定62
• 4.2.2.5 莖環(huán)DNA的甲基化62
• 4.2.2.6 酶循環(huán)放大過程62
• 4.2.2.7 拉曼檢測(cè)62-63
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論63-69
• 4.3.1 實(shí)驗(yàn)原理63
• 4.3.2 紫外表征63-64
• 4.3.3 熒光表征64-65
• 4.3.4 實(shí)驗(yàn)的可行性研究65
• 4.3.5 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化65-68
• 4.3.5.1 拉曼探針中DNA用量的優(yōu)化65-66
• 4.3.5.2 甲基化時(shí)間的優(yōu)化66-67
• 4.3.5.3 DPnI用量的優(yōu)化67
• 4.3.5.4 循環(huán)放大時(shí)間的優(yōu)化67-68
• 4.3.6 甲基化酶的檢測(cè)68-69
• 4.4 本章小結(jié)69-70
• 結(jié)論70-71
• 參考文獻(xiàn)71-77
• 致謝77-78
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表及待發(fā)表學(xué)術(shù)論文目錄78-79

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本文編號(hào)：470754