本文關(guān)鍵詞：利用重組凝集素篩選腫瘤相關(guān)蛋白及其功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腫瘤是威脅人類健康的重要疾病之一。攻克腫瘤這一難題是人類科學(xué)刻不容緩的事,隨著分子生物學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域水平的不斷發(fā)展,發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)蛋白的種類和數(shù)量也不斷的增多,它們在腫瘤細胞中的靜態(tài)分布和動態(tài)移動過程,以及腫瘤細胞周期不同時期的變化。這些腫瘤相關(guān)蛋白可作為檢測腫瘤發(fā)生及變化的標志物。無論是在生物學(xué)領(lǐng)域還是在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,這些腫瘤相關(guān)蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中就起到了非常明顯的作用。凝集素作為一種糖結(jié)合蛋白能夠結(jié)合到腫瘤細胞膜表面的糖分子。生物膜中含有一定量的糖類,主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素最大的特點在于它們能識別糖蛋白和糖肽,特別是細胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu),即細胞膜表面的碳脂化合物決定簇,一種凝集素具有對某一種特異性糖基專一性結(jié)合的能力。因此,用凝集素可以篩選出腫瘤細胞表面的特異性糖蛋白。本課題利用鱸魚凝集素(Dicentrarchus labrax lectin,DLL)、紫海膽凝集素(Strongylocentrotus purpuratus lectin,SPL)、盤鮑魚唾液酸凝集素(Haliotis discus discus Lectin,HDDL)和人抑制性受體信號調(diào)節(jié)蛋白(inhibitory receptor signal regulator protein,SIRPα)構(gòu)建了sCAR-DLL、sCAR-SPL、sCAR-HDDL、sCAR-SIRPα這四種融合蛋白作為篩選腫瘤相關(guān)蛋白的工具。融合蛋白的sCAR部分是腺病毒受體的膜外片段,能夠和5型腺病毒結(jié)合;融合蛋白的凝集素部分可與腫瘤細胞膜上的某些糖蛋白結(jié)合,SIRPα是CD47的受體,在這里作為對照蛋白。因此,這些融合蛋白可以通過橋連作用,使腺病毒通過細胞膜糖蛋白特異感染凝集素識別的腫瘤細胞。實驗中,將這些融合蛋白分別和攜帶綠色熒光蛋白基因的腺病毒Ad-EGFP聯(lián)合處理各種腫瘤細胞,通過熒光顯微鏡觀察,以帶綠色熒光細胞的比例顯著增加作為凝集素識別腫瘤細胞的關(guān)鍵指標。首先,我們構(gòu)建了sCAR-DLL、sCAR-SPL、sCAR-HDDL和sCAR-SIRPα這四種融合基因,并將其連接到原核表達載體pQE30上。待完成鑒定工作后,將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)到M15原核表達菌株中。通過IPTG誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下,成功誘導(dǎo)出四種融合蛋白的表達,而且是以包涵體的形式表達。隨后,我們又將大量誘導(dǎo)出的蛋白進行Ni離子親和層析純化及包涵體復(fù)性。經(jīng)過鑒定,我們純化出純度較高的融合蛋白。隨后我們又將這幾種融合蛋白和Ad-EGFP共同作用于7721、A549、Hep3B、PLC和Hela細胞,發(fā)現(xiàn)融合蛋白sCAR-DLL對Ad-EGFP感染7721、A549、Hep3B和Hela細胞的作用都不明顯;融合蛋白sCAR-SPL顯著增強Ad-EGFP對A549和Hela細胞的感染效率,而對7721和Hep3B細胞的作用不明顯;融合蛋白sCAR-HDDL對Ad-EGFP感染7721、A549、Hep3B和Hela細胞的作用也都不明顯,但提高腺病毒對PLC細胞的感染效率.融合蛋白sCAR-SIRPα對Ad-EGFP感染各種腫瘤細胞的作用沒有明顯差異。綜上所述,本課題構(gòu)建了四種融合蛋白作為工具蛋白,并和Ad-EGFP聯(lián)合作用感染多種腫瘤細胞,通過熒光顯微鏡觀察Ad-EGFP對腫瘤細胞的感染效率。結(jié)果表明,融合蛋白對各種腫瘤細胞具有一定的識別特異性,提示凝集素DLL、SPL及HDDL能特異識別某些腫瘤細胞膜上的糖蛋白。以后將進一步鑒定各種凝集素所識別的糖蛋白,并對其功能進行研究。
【關(guān)鍵詞】：凝集素 融合蛋白 免疫結(jié)合 腫瘤相關(guān)蛋白
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 縮略語8-11
• 第一章 凝集素在腫瘤治療領(lǐng)域的研究概況11-19
• 1.1 前言11-12
• 1.2 腫瘤研究狀況12-13
• 1.3 凝集素的概況及在腫瘤研究中的應(yīng)用13-18
• 1.3.1 凝集素是種類13-14
• 1.3.2 凝集素的結(jié)構(gòu)特點及功能特點14-16
• 1.3.3 凝集素在腫瘤醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用16-17
• 1.3.4 本研究中所用到的凝集素和所構(gòu)建的融合蛋白17-18
• 1.4 本課題的來源及研究意義18-19
• 1.4.1 課題來源18
• 1.4.2 課題的意義18-19
• 第二章 實驗器材19-24
• 2.1 生化試劑19-20
• 2.2 主要試劑配制20-22
• 2.3 實驗儀器22
• 2.4 主要質(zhì)粒、菌種22-23
• 2.5 引物設(shè)計與合成23-24
• 第三章 實驗方法24-34
• 3.1 重組凝集素基因的構(gòu)建24-30
• 3.1.1 DLL、SPL、HDDL、SIRP基因的獲得24-28
• 3.1.2 原核表達載體的構(gòu)建28-30
• 3.2 融合蛋白的原核表達、純化及鑒定30-34
• 3.2.1 融合蛋白的誘導(dǎo)表達及鑒定30
• 3.2.2 融合蛋白可溶性的鑒定30-31
• 3.2.3 融合蛋白的純化及包涵體復(fù)性31-34
• 3.3 融合蛋白通過熒光顯微鏡篩選腫瘤相關(guān)蛋白34
• 第四章 實驗結(jié)果34-51
• 4.1 原核表達載體構(gòu)建34-39
• 4.1.1 sCAR-Linker凝膠電泳鑒定34-35
• 4.1.2 凝集素基因的凝膠電泳鑒定35-36
• 4.1.3 融合PCR凝膠電泳鑒定36-37
• 4.1.4 原核表達載體構(gòu)建鑒定37-39
• 4.2 蛋白誘導(dǎo)表達及純化39-46
• 4.2.1 融合蛋白的誘導(dǎo)表達及鑒定39-40
• 4.2.2 融合蛋白的可溶性與不可溶性鑒定40-41
• 4.2.3 融合蛋白純化及包涵體復(fù)性41-46
• 4.3 融合蛋白篩選腫瘤相關(guān)蛋白46-51
• 4.3.1 熒光檢測融合蛋白sCAR-DLL介導(dǎo)Ad-EGFP感染腫瘤細胞46-47
• 4.3.2 熒光檢測融合蛋白sCAR-SPL介導(dǎo)Ad-EGFP感染腫瘤細胞47-48
• 4.3.3 熒光檢測融合蛋白sCAR-HDDL介導(dǎo)Ad-EGFP感染腫瘤細胞48-49
• 4.3.4 熒光檢測融合蛋白sCAR-SIRPα 介導(dǎo)Ad-EGFP感染腫瘤細胞49-51
• 討論51-52
• 結(jié)論52-54
• 參考文獻54-58
• 致謝58-59
• 碩士期間研究成果59

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