發(fā)布時間：2023-11-11 10:54

　　目的:肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國發(fā)病率和死亡率分別位居第四位和第三位的癌癥“殺手”,到目前為止仍缺乏有效的防治手段。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)慢性感染與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但相關(guān)的分子機(jī)制仍不清楚。因此本研究擬初步探討HCV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NS2和NS3/4A對細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的影響,以期為HCV感染相關(guān)的HCC發(fā)病機(jī)制提供新的視角。方法:1.質(zhì)粒構(gòu)建:以p CMV-tag2B為載體,以HCV 2a型JFH-1株基因為模板,采用雙酶切法構(gòu)建HCV NS2基因的重組載體p CMV-tag2B-NS2,經(jīng)酶切和DNA測序進(jìn)行鑒定;2.WB和DAPI染色分析:在Huh7細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染空載體、HCV NS2及NS3/4重組載體后,采用Western blot和/或DAPI染色分析不同藥物處理(CPT、Taxol及Nutlin-3)處理時HCV蛋白對DNA損傷應(yīng)答信號和凋亡的影響;3.免疫熒光檢測:在U2OS細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染空載體、HCV NS3/4A重組載體后,用免疫熒光方法檢測γ-Tubulin和α-Tubulin...

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

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前言
第一部分 HCV NS2蛋白對細(xì)胞凋亡及DNA損傷應(yīng)答信號的影響
    1 材料與試劑
        1.1 細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒
        1.2 實驗試劑
        1.3 常用試劑的配制
        1.4 儀器
    2 實驗方法
        2.1 重組質(zhì)粒pCMV-tag2B-NS2的構(gòu)建
        2.2 Western blot檢測HCV NS2蛋白的表達(dá)
        2.3 DAPI染色檢測細(xì)胞凋亡
        2.4 Western blot檢測DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白的表達(dá)
        2.5 FACS檢測細(xì)胞
        2.6 統(tǒng)計學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 HCV NS2基因的擴(kuò)增
        3.2 pCMV-tag2B-NS2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
        3.3 pCMV-tag2B-NS2重組質(zhì)粒在Huh7細(xì)胞中的表達(dá)
        3.4 HCV NS2蛋白對Huh7細(xì)胞凋亡的影響
        3.5 HCV NS2蛋白對Huh7細(xì)胞DNA損傷應(yīng)答的影響
        3.6 HCV NS2蛋白對Huh7細(xì)胞周期的影響
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分HCV NS3/4A蛋白對細(xì)胞DNA損傷和有絲分裂的影響
    1 材料與試劑
        1.1 細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒
        1.2 實驗試劑
        1.3 常用試劑的配制
        1.4 儀器
    2 實驗方法
        2.1 Huh7細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞
        2.3 免疫熒光法檢測細(xì)胞有絲分裂及中心體
        2.4 Western blot檢測DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白的表達(dá)
        2.5 FACS檢測細(xì)胞
        2.6 MTT法檢測細(xì)胞增殖活力
        2.7 統(tǒng)計學(xué)分析
    3 實驗結(jié)果
        3.1 HCV NS3/4A蛋白對Huh7細(xì)胞DNA損傷應(yīng)答信號活化的影響
        3.2 HCV NS3/4A蛋白對細(xì)胞有絲分裂的影響
        3.3 HCV NS3/4A蛋白對細(xì)胞中心體的影響
        3.4 藥物處理后HCV NS3/4A蛋白對細(xì)胞DNA損傷應(yīng)答信號的影響
        3.5 HCV NS3/4A蛋白對細(xì)胞周期的影響
    4 討論
    5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果
個人簡歷



本文編號：3862492