研究背景免疫檢查點是一類免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)分子,參與自身耐受,防止自身攻擊和免疫過度。免疫檢查點分為激活型和抑制型兩類。抑制型免疫檢查點在腫瘤微環(huán)境中常被腫瘤細胞所利用,抑制免疫細胞活性,實現(xiàn)免疫逃逸,常見于活化的T淋巴細胞抑制型免疫檢查點包括PD-1(CD279)、CTLA-4(CD152)、LAG3(CD223)、TIM-3(CD366)、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)等。細胞程序性死亡受體(PD-1),在死亡誘導(dǎo)過程中起到重要的作用。PD-1與配體的結(jié)合上調(diào)E3-泛素連接酶CBL-b和c-CBL,觸發(fā)T細胞受體下調(diào),抑制T細胞的活化及細胞因子的釋放。PD-L1低表達于活化的T細胞、樹突狀細胞、B細胞、單核細胞、角質(zhì)形成細胞等。在非小細胞肺癌中也見到PD-L1的高表達。在腫瘤微環(huán)境中,PD-L1通過失活細胞毒性T細胞來為腫瘤細胞提供免疫逃逸,有報道顯示PD-L1可以作為腫瘤免疫治療的預(yù)測性指標(biāo)。據(jù)2015年統(tǒng)計,中國最常見的癌癥肺癌,也是中國癌癥相關(guān)死亡的主要原因,緊隨其后的是胃癌、食管癌和肝癌。非小細胞肺癌約占肺癌病例的80-85%。與小細胞肺癌相比,非小細胞肺癌對化療不敏感,主要...

【文章頁數(shù)】：144 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第1章 文獻綜述
    1.1 免疫檢查點研究進展
        1.1.1 程序性死亡受體PD-1及配體
        1.1.2 其他抑制性免疫檢查點
    1.2 NSCLC治療的研究進展
    1.3 CAR-T在免疫治療中的應(yīng)用
    1.4 CRISPR/Cas9在腫瘤治療中的應(yīng)用
    1.5 本課題研究目標(biāo)、內(nèi)容與特色
        1.5.1 研究目標(biāo)
        1.5.2 研究內(nèi)容
        1.5.3 研究特色與意義
第2章 材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞
        2.1.2 主要試劑與耗材
        2.1.3 流式抗體
        2.1.4 主要試劑的配制
        2.1.5 載體質(zhì)粒
        2.1.6 引物序列
        2.1.7 主要實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 抗體的標(biāo)記
        2.2.2 標(biāo)記抗體的檢測
        2.2.3 蛋白濃度測定
        2.2.4 多肽沖擊PBMC
        2.2.5 流式檢測PD-1表達情況
        2.2.6 流式檢測PD-1單抗藥物與PBMC的結(jié)合情況
        2.2.7 溫度和時間對PD-1抗體體外封閉的影響
        2.2.8 腫瘤細胞表達的PD-L1對體外封閉的影響
        2.2.9 PBMC與NCI-H358的共培養(yǎng)
        2.2.10 流式檢測共培養(yǎng)的PBMC CD8+、CD4+和PD-1+
        2.2.11 LDH法檢測PBMC殺傷效果
        2.2.12 表達載體的構(gòu)建
        2.2.13 慢病毒包裝
        2.2.14 慢病毒濃縮
        2.2.15 慢病毒滴度測定
        2.2.16 慢病毒感染PBMC
        2.2.17 慢病毒感染效率的測定
        2.2.18 流式檢測細胞凋亡
        2.2.19 細胞因子的檢測—ELISA檢測法
        2.2.20 流式細胞分型
        2.2.21 CRISPR敲除載體的構(gòu)建
        2.2.22 流式檢測CRISPR敲除效率
        2.2.23 流式檢測PBMC CRISPR靶基因敲除效率
        2.2.24 統(tǒng)計學(xué)分析
第3章 結(jié)果
    3.1 PD-1單抗分子的組成及標(biāo)記
        3.1.1 SDS-PAGE分析PD-1單抗藥
        3.1.2 PD-1單抗藥的熒光標(biāo)記
        3.1.3 標(biāo)記的PD-1單抗藥檢測PBMC上PD-1的表達情況
        小結(jié)
    3.2 淋巴細胞培養(yǎng)過程中PD-1+細胞比例的變化
        3.2.1 多肽沖擊共培養(yǎng)過程中PD-1+細胞比例的變化
        3.2.2 PBMC與腫瘤細胞共培養(yǎng)過程中PD-1+細胞比例的變化
        小結(jié)
    3.3 PD-1單抗藥對PBMC的封閉效果
        3.3.1 PD-1抗體藥物在pH5.8、pH6.6、pH7.2和pH8.0的緩沖體系中結(jié)合情況
        3.3.2 PD-1抗體藥物在pH 6.6、pH6.8和pH7.4的緩沖體系中結(jié)合情況
        3.3.3 pH值降低后,已結(jié)合的PD-1抗體藥物是否會解離
        3.3.4 在原pH值條件下結(jié)合的穩(wěn)定性分析
        小結(jié)
    3.4 體外封閉后遇到腫瘤細胞上的PD-L1是否會解離
        3.4.1 細胞因子刺激對K562細胞PD-L1表達水平的影響
        3.4.2 細胞因子刺激對A549細胞PD-L1表達水平的影響
        3.4.3 細胞因子刺激對NCI-H358細胞PD-L1表達水平的影響
        3.4.4 熒光掃描儀檢測體外封閉情況
        3.4.5 PD-L1表達腫瘤細胞對體外封閉的影響
        3.4.6 PD-L1高表達腫瘤細胞對體外封閉的影響
    3.5 PD-1單抗藥體外封閉時間和溫度對封閉效率的影響
        3.5.1 封閉溫度、封閉時間對封閉情況的影響
        3.5.2 PBS體系中25℃ 1h的封閉情況
        3.5.3 PBS體系中25℃ 2h的封閉情況
        3.5.4 PBS體系中37℃ 1h的封閉情況
        3.5.5 不同溫度、時間和封閉條件的比較
        小結(jié)
    3.6 培養(yǎng)液OKM200+5%FBS或生理鹽水作為封閉環(huán)境
        3.6.1 在細胞培養(yǎng)基中37℃1h的封閉情況
        3.6.2 PBMC在0.9% NaCl中的封閉情況
        小結(jié)
    3.7 80%左右的封閉效果是否會影響PBMC的殺傷活性
        3.7.1 體外封閉對PBMC殺傷效果的影響——LDH法
        小結(jié)
    3.8 PD-L1嵌合抗原受體的表達
        3.8.1 PD-L1抗體慢病毒表達載體的構(gòu)建
        3.8.2 轉(zhuǎn)染體系的確定
        3.8.3 慢病毒滴度的測定
        3.8.4 慢病毒感染PBMC
        3.8.5 PBMC表達PD-L1嵌和抗原抗體
        小結(jié)
    3.9 PBMC培養(yǎng)條件的確定
        3.9.1 活化條件對PBMC組分的影響
        3.9.2 CAR-T細胞體外擴增
        小結(jié)
    3.10 CAR-T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用
        3.10.1 表達PD-L1 scFv-28Bz的PBMC對NCI-H358的殺傷作用
        3.10.2 表達PD-L1 scFv-28Bz的PBMC對A549(PD-L1低表達)的殺傷效果
        3.10.3 CD8+、CD4+及PD-1+的細胞比例
        3.10.4 共培養(yǎng)上清中細胞因子水平
        小結(jié)
    3.11 基于CRISPR/Cas9方法的免疫檢查點敲除位點篩選
        3.11.1 腫瘤患者免疫檢查點表達水平的多樣性
        3.11.2 293TN細胞PD-1等免疫檢查點的表達情況
        3.11.3 293TN細胞PD-1等免疫檢查點過表達細胞系的建立
        3.11.4 基于慢病毒載體CRISPR-GFP的PD-1敲除載體的構(gòu)建
        3.11.5 PD-1敲除靶點的篩選
        3.11.6 PBMC PD-1的敲除
        3.11.7 其它免疫檢查點敲除靶點的篩選
        小結(jié)
第4章 討論
    4.1 單克隆抗體封閉對殺傷的影響
    4.2 PD-L1 CAR-T對PD-L1高表達非小細胞肺癌的殺傷作用
    4.3 基于CRISPR/Cas9技術(shù)的免疫檢查點敲除靶點的篩選
第5章 結(jié)論
參考文獻
作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果
致謝
附件



本文編號：3763684