研究背景免疫檢查點(diǎn)是一類(lèi)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)分子,參與自身耐受,防止自身攻擊和免疫過(guò)度。免疫檢查點(diǎn)分為激活型和抑制型兩類(lèi)。抑制型免疫檢查點(diǎn)在腫瘤微環(huán)境中常被腫瘤細(xì)胞所利用,抑制免疫細(xì)胞活性,實(shí)現(xiàn)免疫逃逸,常見(jiàn)于活化的T淋巴細(xì)胞抑制型免疫檢查點(diǎn)包括PD-1(CD279)、CTLA-4(CD152)、LAG3(CD223)、TIM-3(CD366)、殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)等。細(xì)胞程序性死亡受體(PD-1),在死亡誘導(dǎo)過(guò)程中起到重要的作用。PD-1與配體的結(jié)合上調(diào)E3-泛素連接酶CBL-b和c-CBL,觸發(fā)T細(xì)胞受體下調(diào),抑制T細(xì)胞的活化及細(xì)胞因子的釋放。PD-L1低表達(dá)于活化的T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞等。在非小細(xì)胞肺癌中也見(jiàn)到PD-L1的高表達(dá)。在腫瘤微環(huán)境中,PD-L1通過(guò)失活細(xì)胞毒性T細(xì)胞來(lái)為腫瘤細(xì)胞提供免疫逃逸,有報(bào)道顯示PD-L1可以作為腫瘤免疫治療的預(yù)測(cè)性指標(biāo)。據(jù)2015年統(tǒng)計(jì),中國(guó)最常見(jiàn)的癌癥肺癌,也是中國(guó)癌癥相關(guān)死亡的主要原因,緊隨其后的是胃癌、食管癌和肝癌。非小細(xì)胞肺癌約占肺癌病例的80-85%。與小細(xì)胞肺癌相比,非小細(xì)胞肺癌對(duì)化療不敏感,主要...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 免疫檢查點(diǎn)研究進(jìn)展
        1.1.1 程序性死亡受體PD-1及配體
        1.1.2 其他抑制性免疫檢查點(diǎn)
    1.2 NSCLC治療的研究進(jìn)展
    1.3 CAR-T在免疫治療中的應(yīng)用
    1.4 CRISPR/Cas9在腫瘤治療中的應(yīng)用
    1.5 本課題研究目標(biāo)、內(nèi)容與特色
        1.5.1 研究目標(biāo)
        1.5.2 研究?jī)?nèi)容
        1.5.3 研究特色與意義
第2章 材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞
        2.1.2 主要試劑與耗材
        2.1.3 流式抗體
        2.1.4 主要試劑的配制
        2.1.5 載體質(zhì)粒
        2.1.6 引物序列
        2.1.7 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 抗體的標(biāo)記
        2.2.2 標(biāo)記抗體的檢測(cè)
        2.2.3 蛋白濃度測(cè)定
        2.2.4 多肽沖擊PBMC
        2.2.5 流式檢測(cè)PD-1表達(dá)情況
        2.2.6 流式檢測(cè)PD-1單抗藥物與PBMC的結(jié)合情況
        2.2.7 溫度和時(shí)間對(duì)PD-1抗體體外封閉的影響
        2.2.8 腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-L1對(duì)體外封閉的影響
        2.2.9 PBMC與NCI-H358的共培養(yǎng)
        2.2.10 流式檢測(cè)共培養(yǎng)的PBMC CD8+、CD4+和PD-1+
        2.2.11 LDH法檢測(cè)PBMC殺傷效果
        2.2.12 表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.13 慢病毒包裝
        2.2.14 慢病毒濃縮
        2.2.15 慢病毒滴度測(cè)定
        2.2.16 慢病毒感染PBMC
        2.2.17 慢病毒感染效率的測(cè)定
        2.2.18 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        2.2.19 細(xì)胞因子的檢測(cè)—ELISA檢測(cè)法
        2.2.20 流式細(xì)胞分型
        2.2.21 CRISPR敲除載體的構(gòu)建
        2.2.22 流式檢測(cè)CRISPR敲除效率
        2.2.23 流式檢測(cè)PBMC CRISPR靶基因敲除效率
        2.2.24 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
第3章 結(jié)果
    3.1 PD-1單抗分子的組成及標(biāo)記
        3.1.1 SDS-PAGE分析PD-1單抗藥
        3.1.2 PD-1單抗藥的熒光標(biāo)記
        3.1.3 標(biāo)記的PD-1單抗藥檢測(cè)PBMC上PD-1的表達(dá)情況
        小結(jié)
    3.2 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中PD-1+細(xì)胞比例的變化
        3.2.1 多肽沖擊共培養(yǎng)過(guò)程中PD-1+細(xì)胞比例的變化
        3.2.2 PBMC與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)過(guò)程中PD-1+細(xì)胞比例的變化
        小結(jié)
    3.3 PD-1單抗藥對(duì)PBMC的封閉效果
        3.3.1 PD-1抗體藥物在pH5.8、pH6.6、pH7.2和pH8.0的緩沖體系中結(jié)合情況
        3.3.2 PD-1抗體藥物在pH 6.6、pH6.8和pH7.4的緩沖體系中結(jié)合情況
        3.3.3 pH值降低后,已結(jié)合的PD-1抗體藥物是否會(huì)解離
        3.3.4 在原pH值條件下結(jié)合的穩(wěn)定性分析
        小結(jié)
    3.4 體外封閉后遇到腫瘤細(xì)胞上的PD-L1是否會(huì)解離
        3.4.1 細(xì)胞因子刺激對(duì)K562細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平的影響
        3.4.2 細(xì)胞因子刺激對(duì)A549細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平的影響
        3.4.3 細(xì)胞因子刺激對(duì)NCI-H358細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平的影響
        3.4.4 熒光掃描儀檢測(cè)體外封閉情況
        3.4.5 PD-L1表達(dá)腫瘤細(xì)胞對(duì)體外封閉的影響
        3.4.6 PD-L1高表達(dá)腫瘤細(xì)胞對(duì)體外封閉的影響
    3.5 PD-1單抗藥體外封閉時(shí)間和溫度對(duì)封閉效率的影響
        3.5.1 封閉溫度、封閉時(shí)間對(duì)封閉情況的影響
        3.5.2 PBS體系中25℃ 1h的封閉情況
        3.5.3 PBS體系中25℃ 2h的封閉情況
        3.5.4 PBS體系中37℃ 1h的封閉情況
        3.5.5 不同溫度、時(shí)間和封閉條件的比較
        小結(jié)
    3.6 培養(yǎng)液OKM200+5%FBS或生理鹽水作為封閉環(huán)境
        3.6.1 在細(xì)胞培養(yǎng)基中37℃1h的封閉情況
        3.6.2 PBMC在0.9% NaCl中的封閉情況
        小結(jié)
    3.7 80%左右的封閉效果是否會(huì)影響PBMC的殺傷活性
        3.7.1 體外封閉對(duì)PBMC殺傷效果的影響——LDH法
        小結(jié)
    3.8 PD-L1嵌合抗原受體的表達(dá)
        3.8.1 PD-L1抗體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.8.2 轉(zhuǎn)染體系的確定
        3.8.3 慢病毒滴度的測(cè)定
        3.8.4 慢病毒感染PBMC
        3.8.5 PBMC表達(dá)PD-L1嵌和抗原抗體
        小結(jié)
    3.9 PBMC培養(yǎng)條件的確定
        3.9.1 活化條件對(duì)PBMC組分的影響
        3.9.2 CAR-T細(xì)胞體外擴(kuò)增
        小結(jié)
    3.10 CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用
        3.10.1 表達(dá)PD-L1 scFv-28Bz的PBMC對(duì)NCI-H358的殺傷作用
        3.10.2 表達(dá)PD-L1 scFv-28Bz的PBMC對(duì)A549(PD-L1低表達(dá))的殺傷效果
        3.10.3 CD8+、CD4+及PD-1+的細(xì)胞比例
        3.10.4 共培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平
        小結(jié)
    3.11 基于CRISPR/Cas9方法的免疫檢查點(diǎn)敲除位點(diǎn)篩選
        3.11.1 腫瘤患者免疫檢查點(diǎn)表達(dá)水平的多樣性
        3.11.2 293TN細(xì)胞PD-1等免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)情況
        3.11.3 293TN細(xì)胞PD-1等免疫檢查點(diǎn)過(guò)表達(dá)細(xì)胞系的建立
        3.11.4 基于慢病毒載體CRISPR-GFP的PD-1敲除載體的構(gòu)建
        3.11.5 PD-1敲除靶點(diǎn)的篩選
        3.11.6 PBMC PD-1的敲除
        3.11.7 其它免疫檢查點(diǎn)敲除靶點(diǎn)的篩選
        小結(jié)
第4章 討論
    4.1 單克隆抗體封閉對(duì)殺傷的影響
    4.2 PD-L1 CAR-T對(duì)PD-L1高表達(dá)非小細(xì)胞肺癌的殺傷作用
    4.3 基于CRISPR/Cas9技術(shù)的免疫檢查點(diǎn)敲除靶點(diǎn)的篩選
第5章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所取得的科研成果
致謝
附件



本文編號(hào)：3763684